p53对TGEV诱生I型干扰素的调控作用及其分子机制研究

TGEV could induce the generation of type I interferon when infected piglet or inoculated cells in vitro, to play antiviral effect. p53 can regulate a variety of cell signal pathways to affect virus replication and spread during virus infection. Our previous research found that the early activation of p53 inhibit the replication of TGEV. It is unknown whether the p53 plays antiviral effect by influencing the generation of type I interferon and interferon signal pathways in early time of TGEV infection. In this study, the role of p53 in TGEV-induced type I interferon generation, and the molecular mechanism of p53 that affect the generation of type I interferon will be researched by siRNA, luciferase reporter gene test, real-time quantitative PCR, laser confocal microscopy, EMSA and western blot technology, to reveal the p53 could adjust the type I interferon mediated congenital antiviral function to play antiviral effect for TGEV, clarify the molecular mechanism of antiviral effect of TGEV during early infection. The results will provide new ideas and methods for the research of antiviral drugs through the cellular signaling molecular angle, provide theoretical basis and help for prevention and treatment of TGEV.

TGEV感染仔猪或体外接种细胞能显著诱导I型干扰素的的产生，借以发挥抗病毒作用。病毒感染过程中，p53可通过调节多种细胞信号转导通路影响病毒的复制和传播。项目组前期研究发现p53的早期活化抑制了TGEV的复制，那么在TGEV感染早期p53是否通过调控I型干扰素的产生及干扰素信号通路而发挥抗病毒的作用，目前尚未可知。本项目拟采用RNA干扰技术、荧光素酶报告基因试验、实时荧光定量PCR、激光共聚焦、EMSA及western blot技术等研究p53对TGEV诱生I型干扰素的调控作用，并深入研究p53调控TGEV诱生I型干扰素的分子机制，从而揭示p53通过调节I型干扰素介导的先天性抗病毒作用来发挥抗TGEV的作用，阐明TGEV感染早期p53抗病毒效应的分子机理。研究成果为以细胞信号分子为药物靶标进行抗病毒药物的研究提供思路和方法，为防治TGEV提供理论依据和帮助。

TGEV主要引起仔猪的急性、接触性肠道传染病，近年来该病在我国的流行呈明显上升趋势，给我国养猪业造成了严重的经济损失。课题组前期研究表明，TGEV感染宿主细胞可诱导细胞周期阻滞和凋亡，而p53起到了关键调控作用，并可能参与宿主的先天性抗病毒免疫。因此，本项目重点研究p53在TGEV诱导的I型干扰素中的调控作用，并对其分子机制展开深入的探讨。首先采用CRISPR-Cas9 慢病毒系统构建了p53基因敲除的稳定细胞株，应用TGEV感染p53-/-细胞和p53+/+细胞株，对干扰素的产生途径及干扰素信号通路进行了探究。结果表明：0.1 MOI TGEV感染细胞后，p53-/-细胞内的IFN-β mRNA表达量以及细胞上清中IFN-β分泌量显著低于同时间点p53+/+细胞。I型干扰素的胞质诱导途径中RIG-I、MDA5、MAVS和跨膜诱导途径中TRIF、TRAM等的mRNA和蛋白表达水平显著升高，且TGEV感染的p53-/-细胞中的水平低于p53+/+细胞；两种途径抑制剂可显著下调IFN-β mRNA的表达。I型干扰素信号通路中JAK/STAT 通路和PI3K/Akt 通路在病毒感染的早期，p53+/+细胞和p53-/-细胞中的表达水平上升，但在病毒感染的36 h下调；而MAPK 通路在TGEV感染的p53+/+细胞和p53-/-细胞中，p38 MAPK显著上调，但是JNK和ERK变化不明显。同时，p53+/+细胞和p53-/-细胞中发挥抗病毒效应的分子如IRF9、IRF3、ISG15和ISG20等的mRNA表达随着TGEV感染时间的延长逐渐增加，而p53-/- 细胞中的表达水平显著低于p53+/+细胞。此外，p53-/-细胞中，TGEV基因组RNA（gRNA）、亚基因组RNA（ORF7和N基因）的表达量在病毒感染的12 h显著上升，与p53+/+细胞中的gRNA、ORF7及N基因表达量相比显著增加。干扰素诱导剂poly（I:C）和外源性的干扰素处理细胞后，TGEV的gRNA、ORF7及N基因表达量显著低于未处理组，且在p53+/+细胞中的表达低于p53-/-细胞。研究结果阐明了TGEV感染早期p53抗病毒效应的分子机理，为以细胞信号分子为药物靶标进行抗病毒药物的研究提供思路和方法，为防治TGEV提供理论依据和帮助。