表达siat7e基因和tmprss2基因MDCK细胞系的建立

采用基因转染技术，将控制细胞贴壁特性的siat7e基因转染MDCK细胞，通过荧光检测和RT-PCR法，分别进行表型和基因型鉴定。建立检测该基因的荧光定量RT-PCR法，用于筛选高水平表达siat7e基因的MDCK细胞克隆，经过2次克隆筛选，获得适应全悬浮培养的MDCK细胞。在此基础上，采用强力霉素诱导型启动子rtTA，替换CMV启动子，获得tmprss2基因的诱导型表达载体，转染上述经悬浮改造的MDCK细胞，使其在强力霉素的诱导下，可表达tmprss2基因，产生丝氨酸蛋白酶以裂解禽流感病毒HA前体蛋白，实现在不添加胰酶的条件下，支持禽流感病毒的体外增殖。进而建立双表达MDCK细胞的悬浮细胞库，逐步降低培养液中血清含量，驯化细胞适应无血清培养条件。检测细胞的游离氨基酸代谢情况，利用基于DOE的7因子?因素培养基优化策略，获得其个性化培养基，为应用MDCK细胞生产禽流感疫苗奠定基础。

MDCK细胞是目前公认的最适合禽流感生产的细胞系之一，由于MDCK贴壁性强较难驯化，限制了其在工业化大生产上的应用。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一，β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶I(st3galI)基因编码的产物能提高宿主细胞对禽流感病毒的敏感性。本项目通过对MDCK细胞转染siat7e和st3galI基因，以期来获得适应悬浮培养和可产高滴度禽流感病毒的细胞株。.本研究从人和鸡的血液样品中克隆得到siat7e基因和st3galI基因，构建pReceiver-siat7e-st3galI重组表达载体。经双酶切、PCR及DNA测序分析，证实重组载体构建成功。将重组表达载体，以150V，5ms的条件，电击转染MDCK细胞后48h显微镜观察可见绿色荧光，表明双基因成功表达。采用两次有限稀释法挑选到32个单细胞克隆，经基因组PCR和RT-PCR鉴定，得到10株双基因均为阳性的B3-1、B3-2、B3-3、C5、D5、S5-1、CV9、CV10、E2、F2单细胞克隆株。建立了检测siat7e基因和st3gal I基因的TaqMan探针相对荧光定量PCR方法，并结合流式细胞筛选技术从挑选的10个单细胞克隆中筛选出一株双基因均稳定高表达的MDCK-C5细胞株。将H9N2 A株 C5代毒接种贴壁的MDCK和MDCK-C5细胞，血凝效价测定结果表明在MDCK-C5细胞上病毒滴度高于MDCK细胞。建立了MDCK-C5细胞的原始细胞库，并进行了全面鉴定，结果表明，该细胞株无细菌、霉菌、支原体和外源病毒，核型正常，是一株纯净的细胞系；采用逐渐降低血清浓度的方法悬浮驯化MDCK-C5细胞株，细胞密度可达1.3×106cells/mL，并且细胞活力维持在60%以上。以无血清培养基SFM为基础配方，通过对葡萄糖与氨代谢相关的氨基酸，以及硫酸葡聚糖和酵母水解物浓度的调整，获得了其个性化无血清培养基C5-SFM。在NBS BioFlo 310型生物反应器中，采用优化的个性化培养基，悬浮培养MDCK-C5细胞，接种H9N2 A株禽流感病毒，病毒含量EID50可达10-5.69/0.1mL，血凝效价可达2-8。.本试验成功获得适应悬浮生长和可产高滴度禽流感病毒的MDCK-C5细胞株及其个性化无血清培养基，为工业化纯悬浮大规模生产奠定了基础。