Micro RNA-210调控糖尿病脂肪来源干细胞生物学活性及促创面愈合的实验研究

Diabetic wound increased social and medical burden and affected the quality of life. hADSCs were an effective method for curing diabetic wound by secreting a variety of growth factors and differentiation into endothelial cells, nerve cells, etc.However, Whether biological function of diabetes hADSCs were damaged or not and the mechanism was still unclear.Hence,we will study biological activity of adipose-derived stem cells from diabetes mellitus, preprocessing with high sugar and glycosylation end products,transfection MiR-210,including proliferation and cell cycle, quantitative research of differentiation into osteoblast,adipose cells and endothelial cells, promoting endothelial cell migration, detection of self-renewal genes and telomerase activity, cytokines array analysis, detection of micro RNAs by microarray chip,detection of HIF-1,ROS/AKT,PTPN2 and PTP1B by RT-PCR , and to study the mechanism of accelerating wound healing of nude mice through hADSCs transplant. This study will clarify cell and molecular mechanism of impaired diabetic hADSCs and verify the feasibility of simulating diabetes microenvironment in vitro, and to establish theoretical foundation for restoreing biological function of diabetes hADSCs and transplanting autologous hADSCs to diabetic wound.

糖尿病创面增加社会医疗负担，影响生存质量。hADSCs分泌多种生长因子、局部分化为内皮细胞、神经细胞等，是治疗糖尿病创面的有效方法。而糖尿病hADSCs功能是否受损及机制仍不清楚。因此，本项目研究糖尿病hADSCs、高糖和糖基化终末产物处理后的hADSCs、转染MiR-210的hADSCs生物学特性，包括增殖和细胞周期，定量研究成骨、成脂、成内皮细胞分化，促内皮细胞迁移研究，自我更新基因和端粒酶活性检测，细胞因子阵列分析，微阵列芯片检测微小RNAs，RT-PCR检测HIF-1、ROS/AKT、PTPN2和PTP1B表达，同时研究上述hADSCs促裸鼠创面愈合的能力及机制。本项目将阐明糖尿病hADSCs功能受损的细胞分子机制，验证体外模拟糖尿病微环境的可行性，为恢复糖尿病hADSCs生物学功能，将自体hADSCs应用于糖尿病创面奠定理论基础。

糖尿病导致的难愈性创面是非创伤性截肢最主要的原因，基于ADSCs的干细胞疗法已成为促进糖尿病创面愈合最有前景的方法之一。然而，糖尿病来源的ADSCs促创面愈合能力可能减弱。本项目对比研究正常脂肪来源干细胞（N-hADSCs）、糖尿病脂肪来源干细胞（D-hADSCs）、高糖和糖基化处理后的脂肪来源干细胞（G-hADSCs）的生物学特性及促创面愈合能力，探讨糖尿病微环境下hADSCs功能受损的机制。结果显示糖尿病微环境减弱hADSCs的增殖、侵袭、迁移和血管生成能力，促进hADSCs成脂分化，降低其成骨分化潜能，抑制hADSCs促糖尿病鼠创面愈合；转录组测序和生物信息学分析显示hADSCs在糖基化产物干预后miR-1248的表达明显减少，而增强miR-1248，三种hADSCs分泌更多的血管生成因子，抑制miR-1248，三种hADSCs分泌血管生成因子明显减少；通过数据库预测miR-1248 调控的下游靶基因为CITED2，抑制miR-1248，在N-hADSCs中可增加CITED2的表达；增强miR-1248，在G-hADSCs中可抑制CITED2的表达，随后的双荧光素酶报告实验进一步证实miR-1248可负调控CITED2的表达。CITED2作为HIF-1α的竞争性拮抗蛋白，在CITED2敲除后HIF-1α及下游的血管生成基因的表达均升高，而在D-hADSCs和G-hADSCs中HIF-1α的表达明显减弱，因此，我们推测糖尿病的糖脂毒性可能通过抑制hADSCs中miR-1248表达，从而导致CITED2高表达，进而抑制HIF-1α的活性，影响血管新生。而在糖尿病鼠创面局部移植增强或抑制miR-1248的G-hADSCs，相对于单纯的G-hADSCs，增强miR-1248的G-hADSCs明显加速糖尿病鼠创面愈合，组织学结果显示增强miR-1248的G-hADSCs处理组血管新生更明显。本项目首次发现miR-1248可一定程度恢复高糖和糖基化干预后的hADSCs的血管新生能力从而促进糖尿病鼠创面愈合，为糖尿病微环境损伤hADSCs生物学功能提供了一个新的分子机制，即miR-1248介导的CITED2/HIF-1α通路机制，为糖尿病hADSCs找到了一条较理想的恢复生物学功能的途径,具有潜在的临床应用空间。