MEF2D 对大体积脂肪组织成肌诱导分化的调控及其应用研究

Large-scale skeletal muscle defection and function impairment had perplexed surgical specialists for a long time. Recent years, tissue engineering technology provides a promising way to solve this problem. Our preliminary studies have shown some progress in investigating vascularized rat adipose tissue-induced myogenic differentiation. We found that expression level of muscle enhancement factor 2D (MEF2D) was positively correlated with bulky adipose tissue-induced muscle tissue differentiation. In addition, a large amount of exosomes containing MEF2D mRNA were released during myogenic differentiation. These results suggest that MEF2D may be an important factor in muscular tissue engineering that regulating myogenic differentiation. In the current study, we aim to further explore the molecular mechanism of bulky adipose tissue myogenic differentiation; investigate the potential feedback regulation between MEF2D and its downstream targets miR-21, miR-1 and Adiponectin; and determine the biological significance and function of MEF2D up-regulation in myogenic differentiation and the secretion of its mRNA by exosomes. Moreover, using molecular biological methods to remodel the expression of MEF2D mRNA in ADSCs exosomes, we can investigate the induction time and regulation methods of myogenic differentiation, solve the technological puzzles in myogenic engineering such as long induction period and incomplete differentiation, and eventually lay the foundation for clinical application.

大范围骨骼肌组织缺损和功能损伤是长期困扰外科专业的棘手问题。近年快速发展的组织工程技术为解决这一难题提供了希望。我们在前期开展的带血管蒂的大鼠脂肪组织块成肌诱导分化的研究中发现：肌肉增强因子2D（MEF2D）表达随脂肪组织成肌分化程度增加而逐步升高；同时富含MEF2D mRNA的大量外泌体被释放，提示MEF2D可能是肌组织工程学中参与调节成肌分化的重要因子。本项目拟进一步探讨带血管蒂大体积脂肪组织成肌化的分子机制，鉴定MEF2D与其潜在下游调控靶标miR-21，miR-1以及Adiponectin形成反馈通路调节成肌分化的可能性；确定MEF2D在成肌分化过程中表达上调以及外泌体分泌其mRNA的生物学意义及功能；并通过人工改造脂肪干细胞外泌体中MEF2D mRNA含量，研究成肌化诱导时间和成肌分化程度的调控方法，以解决诱导时限过长和分化不完全等成肌工程学中的技术瓶颈，为临床应用奠定基础。

肌肉疾病，先天性缺陷等都可能导致骨骼肌外观和更重要的功能的永久性缺陷。这类缺陷，被称为容积性肌肉丢失(VML)。脂肪组织脱细胞基质（DAM）由于容易获取，具有合适的机械性能及良好的生物相容性，在促进受损组织的再生和修复方面具有巨大的潜力。但DAM在肌肉组织工程领域的研究目前仍是一个空白。脂肪干细胞（ADSC）来源广泛，增殖能力强，且具有肌源性分化潜能，被认为肌肉组织工程中优秀的种子细胞。此外，近年来的研究表明，将成肌细胞（myoblast）与ADSC共培养可以促进ADSC的肌源性分化。因此，我们通过灌注式生物反应器获得了大批DAM，将ADSC或ADSC及myoblast种植在支架上预诱导两周启动肌源性分化。随后移植到大鼠VML模型中检测再细胞化的支架对肌肉的修复与再生能力。组织学染色结果显示，与天然脂肪组织相比，DAM组未见细胞核残留，且各类胶原蛋白保留完好。扫描电镜观察到天然脂肪组织中存在饱满的圆形脂肪细胞，DAM中未见脂肪细胞存在，细胞外基质相互连接成纤维网络状结构。接下来，我们进行了DNA定量及糖胺聚糖含量检测以评估脱细胞效率及糖胺聚糖保留情况，结果发现脱细胞处理后DNA含量大幅下降，且糖胺聚糖几乎完全保留。接下来对支架的溶胀率，降解率以及力学性能进行了检测。结果显示支架吸水性较好，可以为细胞后续的增殖分化提供良好的营养运输，支架大约在第十五天左右降解完全，压缩测试显示DAM具有一定力学性能，可以为细胞的附着及组织再生提供良好的力学支撑。为了进一步研究ADSC及ADSC与成肌细胞在体内对肌肉再生的效果，我们将ADSC及ADSC与myoblast种植在支架上进行了2周的预诱导，随后将支架移植到大鼠VML模型中，2个月后评估各组肌肉再生情况。HE及马松染色可见DAM-ADSC组除了脂肪组织重塑外，可以明显看到肌纤维。DAM-ADSC-myoblast组同样可见脂肪再生及少量的肌纤维。免疫组织化学结果显示，各组在生物支架内部新形成的纤维细胞质中有desmin 蛋白，表明该生物支架在体内血管化良好，且种植了预分化细胞的支架在体内可以实现肌纤维的重塑。