带血管蒂的大鼠脂肪组织块成肌诱导分化的实验研究

Nowadays,the field of muscle tissue engineering has evolved to produce efficient muscle tissue by utilizing the regenerative potential of stem cells and their potential for proliferation and maturation which can be harvested from adult and neonatal muscle of different species. However,the quantity and quality of the formation of new skeletal muscle can not meet to repair a wide range of skeletal muscle defect. We adopt a promising novel approach for large volume vascularized engineering muscle tissue from rat groin adipose tissue cultured in perfusion bioreactors. In addition,we implant engineered muscle into rat groin region and keep viability and differentiation using microsurgery skills. The resulting tissue constructs were characterized with respect to morphology and expression of muscle related genes and proteins. Meanwhile, we further study mechanisms of myogenic differentiation in order to better resolve skeletal muscle defect.

传统的肌肉组织工程构建方法仅通过将再生潜力的干细胞接种于支架材料，虽然能够形成些许肌肉样细胞，但是不能满足临床修复大范围骨骼肌缺损的需要。本研究将带血管蒂的大鼠脂肪筋膜组织块进行整块体外组织培养，以其作为活体支架，以组织中主体细胞- - 成熟脂肪细胞为种子细胞，采用灌流式组织生物反应器经生肌培养液灌注，原位诱导组织中成熟脂肪细胞转分化成骨骼肌细胞，在体外构建大块血管化的组织工程骨骼肌组织。采用显微外科技术将体外构建的肌肉组织移植入同品系大鼠体内培养，使其进一步分化成熟为骨骼肌组织。分别对体外及体内构建的肌肉组织行组织病理学检查，通过RT-PCR、免疫组织化学方法检测myoD1,MEF2等肌肉特异性基因蛋白的表达，鉴定其肌肉组织特异性，并研究其成肌转化途径。有效地解决整块大体积再生组织的营养液供应和组织细胞转化问题，初步明确生肌转化的机制,为满足临床大量肌肉组织缺损的修复需要提供实验依据。

目前，对于大面积组织缺损的治疗主要是通过自体肌肉异位移植来进行形态和功能替代，但这种方法可用的肌肉有限，并对供区造成很大的损伤，因而使其应用受到限制。理想的方法是在体外预构具有一定形态、功能并有相当大的体积量的骨骼肌组织植入体内来诱导肌肉新生。现行的组织工程骨骼肌构建方法仅通过将再生潜力的干细胞等种子细胞接种于支架材料，虽然能够形成些许肌肉样细胞，但无论从形成新生骨骼肌的数量还是质量上来讲均不能满足临床修复大范围骨骼肌缺损的需要。本项目采用体外和体内诱导两种策略。利用大鼠体内丰富的带血管蒂的大块脂肪组织于体外灌注式生物反应器培养环境下，通过调控脂肪组织内的成体干细胞，诱导其分化为肌肉的稳定方法。体外构建的组织工程化肌肉组织的组织学（Masson染色）观察，免疫荧光法对组织活力测定，Western blotting法测定不同时间样品肌肉特异性蛋白基因MyoD1, Desmin, N cadherin and ADAM12的表达，PCR法选取肌肉特异性基因myosin, MEF2D, desmin, ADAM12 and M-cadherin，测定其mRNA在不同时间分化组织的的表达。进一步利用显微外科技术将体外诱导的组织工程大块肌肉植入体内继续诱导分化，免疫荧光法测定植入后组织活力，及组织学观察（HE染色和Masson染色），提取体内组织工程肌肉组织的RNA。为临床满足群体性、大量肌肉组织缺损修复的需要提供理论依据。