牛MSCs成肌/成脂分化中差异miRNAs的分离及调控机制

Skeletal muscle cells and adipocytes are derived from the mesenchymal stem cells (MSCs) of embryonic mesoderm. The number and ratio of MSCs commitment to myogenic or adipogenic lineage are a crucial mechanism of adipose deposit phenotype in cattle. However, the mechanism of adipogensis in embryo and fetus period and the regulation of miRNA are not very clear. We will investigate the different miRNAs and their potential target genes in differentiation of MSCs towards muscle cell and adipocyte by miRNA sequencing and bioinformatics analysis. Based on dual luciferase report assay, miRNA-target interaction analysis will be performed. The effects of miRNAs and their target genes on MSCs differentiation to muscle cells and adipocytes will be evaluated by over-expression and RNAi methods. Finally, we will preliminarily confirm the regulation mechanism of miRNAs in MSCs differentiation to muscle cells and adipocytes. It will help us to know the importance of miRNAs function in MSCs commitment to myogensis and adipogensis, and provide the theory basis to intramuscular deposit mechanism in beef cattle.

胚胎期中胚层的间充质干细胞是骨骼肌和脂肪组织的共同祖先，胚胎期间充质干细胞向二者定向发育的数量和比例是肉牛后天脂肪沉积表型形成的重要机理之一。然而，对胚胎和胎儿期脂肪发生发育过程的调控机理以及miRNA在调控中的作用尚不完全清楚。本研究拟通过miRNA测序和生物信息学分析，筛选牛胎儿骨骼肌间充质干细胞向骨骼肌和脂肪分化过程中差异表达miRNA及其可能的靶基因；在此基础上，通过双荧光素报告系统在细胞水平上验证miRNA和靶基因的互作，通过基因过表达或RNAi技术验证目的miRNA和靶基因对间充质干细胞成肌/成脂分化的影响。初步探索miRNA在间充质干细胞成肌/成脂分化中的功能及其调控机制，对阐明miRNA在调控间充质干细胞向二者分化过程中的数量分配机制有重要意义，为进一步阐明肉牛肌内脂肪沉积的分子基础提供理论依据。

胚胎期中胚层的间充质干细胞是骨骼肌和脂肪组织的共同祖先，胚胎期间充质干细胞向二者定向发育的数量和比例是肉牛后天脂肪沉积表型形成的重要机理之一。然而，对胎儿期脂肪发生发育过程的调控机理以及miRNA在调控中的作用尚不完全清楚。给予以上科学问题，本项目主要开展了以下研究：（1）以牛胎儿骨骼肌组织为材料，采用IV型胶原酶消化方法，分离得到了牛胚胎骨骼肌来源MSCs，利用免疫荧光技术鉴定胎牛骨骼肌来源MSCs特异性表面标志基因CD106、CD29、CD44，结果全部显示为阳性表达；采用RT-PCR检测MSCs特异性表面标志基因CD44、CD29、CD73、CD90、CD166，结果全部显示为阳性表达。（2）胎牛骨骼肌来源的MSCs经过IBMX、胰岛素、地塞米松和吲哚美辛的联合诱导后形成含有淡黄色发亮脂滴的脂肪细胞，油红O染色结果可清晰看到红色脂滴，RT-PCR检测PPAR-γ、C/EBP α、FABP4阳性表达。MSCs在5%马血清、地塞米松和氢化可的松诱导下，形成具有多核肌管的成肌细胞，成肌细胞分化的特异性标志因子fast skeletal myosin呈阳性表达。（3）分别选取诱导分化前和成肌/成脂诱导分化第6天的细胞样品进行miRNA的建库和测序，在成肌和成脂分化组中分别筛选得到了90和56个差异表达miRNAs。（4）选取了成脂分化中显著下调的miR-23a进行了功能验证。在成脂分化中，诱导1d后其表达量显著降低并保持整个分化过程；过表达miR-23a抑制脂肪分化，脂肪分化相关的转录因子zfp423、PPARg和C/EBPa表达量降低；转染miR-23a抑制物促进脂肪分化，PPARg、C/EBPa表达量升高；通过TargetScan预测miR-23a可能的靶基因为zfp423，通过构建含有预测结合位点的野生型和突变型zfp423 3’UTR序列的双荧光素酶报告载体，确认了miR-23a可以和zfp423 3’UTR结合并抑制荧光素酶的表达。总之，通过以上研究成功分离了牛胎儿骨骼肌来源的MSCs并在体外建立了成肌/成脂分化模型，筛选得到了一系列差异表达miRNAs，并验证了其中miR-23a的生物学功能。