MMP-9通过TGF-β/Smad信号通路调控犬乳腺肿瘤转移的机制

Metastases are the major cause of death from cancer, and tumor microenvironment is of importance in tumor metastasis. What is the role of MMP-9 in the tumor microenvironment and how does it influence the process remain to be clarified. In our previous studies, MMP-9 was found to be highly expressed in canine mammary tumor tissue, and there was a positive correlation with tumor malignancy and metastasis. Based on these data, we speculate that MMP-9 is one of the crucial factors in regulating the process of metastasis in canine mammary tumor. We aim to clarify the function and molecular mechanism of MMP-9 in the metastatic process, and discuss its potential role in TGF-β/Smad pathway through in vivo and in vitro experiments. Besides, we also investigate the effect of targeted suppression of MMP-9 on metastasis in canine mammary tumors, which is verified by means of RT-PCR, Western Blotting, Immunofluorescenc, RNA interference, etc. This study is expected to further explain the metastasis mechanism of canine mammary tumor, and attempt to find a potential medicine in tumor metastasis suppression.

转移是肿瘤引起宿主死亡的主要原因，而发生转移的前提是形成特定的肿瘤微环境。MMP-9在肿瘤微环境形成过程中发挥作用，但具体的机制仍不完全清楚。我们的前期研究发现犬乳腺肿瘤组织中MMP-9的高表达与肿瘤的恶性程度和转移呈正相关，因此推测MMP-9是调控犬乳腺肿瘤转移的重要因素之一。在前期研究的基础上，我们从组织和细胞学、基因和蛋白表达等多方面对MMP-9调控犬乳腺肿瘤转移的过程和分子机制进行阐述，并探讨靶向抑制MMP-9的活性对犬乳腺肿瘤转移的潜在影响。通过建立体内和体外犬乳腺肿瘤转移研究模型，重点阐述MMP-9对肿瘤的侵袭和转移的影响，以及在TGF-β信号通路中的作用，并通过RT-PCR、免疫印迹、免疫染色、基因干扰、抑制剂处理等手段进行验证。本研究有望揭示犬乳腺肿瘤细胞的转移机制，发现抑制肿瘤转移的新药物。

研究背景：乳腺肿瘤组织中MMP-9的高表达与肿瘤的恶性程度和转移呈正相关，因此推测MMP-9是调控犬乳腺肿瘤转移的重要因素之一。在前期研究的基础上，我们从组织和细胞学、基因和蛋白表达等多方面对MMP-9调控犬乳腺肿瘤转移的过程和分子机制进行阐述，并探讨靶向抑制MMP-9的活性对犬乳腺肿瘤转移的潜在影响。.研究内容：.1..收集临床病例，制作石蜡切片，免疫组织化学分析恶性乳腺肿瘤分级种类预后与MMP9表达的相关性。.2..通过体外酶活抑制试验检测36种小分子药物对于MMP9的影响，筛选确定合适的抗MMP9活性的小分子药物。.3..通过CCK8，细胞克隆实验，检测大车前苷（PMS）对肿瘤细胞的抑制作用。.4..利用RT-PCR和Wesetern Blot技术，分析MMP9对TGF-beta/SMAD信号通路的调控作用。.研究结果：.1..免疫组织化学分析显示，MMP9表达上升与肿瘤恶性程度升高预后变差呈现正相关。MMP9高表达组相对于低表达组犬平均存活时间更短，肿瘤恶性程度更高。.2..体外酶活实验证明结果显示 24 种小分子降低了 MMP-9 在体外的酶活性，另外 13 种反而使其酶活性增加（图 3S-1），而 PMS 的抑制效果最强，极显著降低了 MMP-9 的酶活性（P＜0.01）。之后从 24 种小分子中遴选出 7 种进行了分子对接计算，分子结合产生自由能越小则结合力越强。PMS 与 MMP-9 的分子结合自由能为-10.39 kcal/mol，显著低于平均值。.3..PMS对细胞活性检测显示其对肿瘤细胞有显著抑制生长左右，但对正常细胞CHO则无明显作用。.4..通过过表达MMP9与使用MMP9抑制剂，实验确定MMP9可通过促进TGF-beta前体复合物Large latent Complex（LLC）水解为Small Latent Complex（SLC）从而增加TGF-beta的活化来调控TGF-beta的表达，从而促进下游信号通路SMAD相关蛋白表达最终来促进细胞的增殖迁移。.科学意义：结合实验数据，表明大车前苷（PMS）可通过抑制MMP9的活性，从而抑制TGF-beta/SMAD信号通路的活化来抑制细胞的增殖分化与侵袭能力。为PMS作为中药提取物抗肿瘤提供了理论基础。