COX-2/PGE2信号通路调控犬乳腺肿瘤干细胞生长和抗凋亡机制的研究

Cancer stem cells(CSCs) are believed to be responsible for cancer formation and recurrence,and COX-2/PGE2 signaling pathway plays a important role in maintaining the tumor growth. Emerging evidence suggests that inhibiting COX-2 may restrict the growth of CSCs, but the molecular mechanism are still unclear.On studing the canine mammary cancer stem cell, we have found COX-2 coexpresses with Pluripotency-associated nuclear transcrition factor OCT3/4,and make a hypothesis that COX-2/PGE2 is one of most important regulating signal.Basing on the previous studies,Our research will focus on the processes and molecuar mechanism of COX-2/PGE2 in regulating the canine mammary CSCs from histology, cytology,gene and protein expresson respectively.By building up the canine mammary CSCs study model in vivo and vitro,we will observe the impacts of inhibiting or activating COX-2/PGE2 signaling pathway on tumor growth and Wnt signaling pathway and verify the process by RT-PCR, immunoblot, immunostain, gene interference,inhibitor or activator stimulation methods.Our research aims to find out the new pathogenic mechaism of CSCs and target for drug therpy.

肿瘤干细胞被认为是肿瘤形成和复发的潜在原因，而COX-2/PGE2信号通路在维持肿瘤的生长过程中起重要作用，已有的研究证实抑制COX-2可以抑制肿瘤干细胞的生长，但具体的作用机制仍未清楚。我们对犬乳腺肿瘤干细胞的相关研究发现COX-2与多能性相关核转录因子OCT3/4存在共表达现象，并推测COX-2/PGE2是调控犬乳腺肿瘤干细胞的重要信号通路之一。本课题在前期研究的基础上，从组织和细胞学、基因和蛋白表达等方面对COX-2/PGE2调控犬乳腺肿瘤干细胞的过程和分子机理进行研究，探讨靶向抑制COX-2/PGE2对犬乳腺肿瘤干细胞生长的可能性。通过建立体内和体外犬乳腺肿瘤干细胞研究模型，重点阐述抑制或激活COX-2/PGE对肿瘤干细胞生长及Wnt信号通路的影响，并通过RT-PCR、免疫印迹、免疫染色、基因干扰、抑制/激动剂刺激等手段进行验证。本研究有望发现肿瘤干细胞的致病机理及药物治疗靶点。

研究背景：环氧合酶及其限速产物前列腺素E2（COX-2/PGE2）在犬乳腺肿瘤的发生发展中具有多重生物学功能，该信号通路的异常激活可促进肿瘤细胞的增殖、抗凋亡能力以及增加肿瘤复发的风险。.研究内容：.1. 免疫组化化学分析检测COX-2与肿瘤干细胞相关标记在不同乳腺组织中的表达分布和相关性，建立无血清悬浮培养的肿瘤干细胞微乳球模型，进一步分析上述标记的表达类型间的关联性；.2. 利用RT-PCR和Wesetern Blot技术，分析微乳球模型中COX-2/PGE2信号通路、Wnt/β-catenin信号通路相关因子以及干细胞相关标记因子的表达差异，确定异常激活因子, 进而确定COX-2对肿瘤干细胞富集及肿瘤发生的作用。.3. 通过siRNA干扰和COX-2抑制剂靶向抑制细胞中COX-2的表达，同时分析其对肿瘤干细胞特征的影响。.4. 将微乳球细胞接种免疫缺陷小鼠建立体内肿瘤模型，单一使用COX-2抑制剂或者联合化疗药物顺铂观察其对肿瘤的治疗作用。.研究结果：.1. COX-2在正常乳腺、癌前增生以及肿瘤组织中的表达存在明显的差异。在原发性乳腺肿瘤组织中COX-2的表达与CD44和EGFR具有显著的相关性。在微乳球中，COX-2的表达升高与肿瘤的恶性程度相关，并伴随CD44和Oct-3/4的表达上调，进一步提示了COX-2在维持肿瘤干细胞亚群的数量及其性能方面具有潜在作用。.2. 基因差异表达分析结果显示，COX-2、EP2、EP4、β-catenin、Cyclin-D1、Oct-3/4表达存在明显差异，说明了肿瘤干细胞的富集过程伴随COX-2和Wnt信号通路的异常激活。.3. siRNA干扰或者选择性抑制剂可成功降低肿瘤细胞中的COX-2表达水平，并有效减少肿瘤细胞中CD44+/CD24-细胞亚群的比例以及抑制肿瘤细胞的恶性行为，而这些作用可被PGE2所逆转。抑制COX-2的表达可下调β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平，联合顺铂可有效破坏微乳球的形成，增加凋亡细胞的比例。环氧合酶抑制剂可有效抑制小鼠异位移植肿瘤的生长，减少肿瘤组织中肿瘤干细胞的数目。.科学意义：结合试验的所有数据，表明COX-2/PGE2对肿瘤干细胞的生物学性能具有重要的调控作用，而这一作用方式可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。靶向抑制环氧合酶信号通路对犬乳腺肿瘤干