产KPC酶肺炎克雷伯菌中携带fos基因质粒特点及传播机制研究

Due to its good in vitro activity against many carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, fosfomycin has been recently reintroduced into the fight against these superbugs, including Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing K. pneumoniae (KPC-KP) strains. In our previous study, only 43% of KPC-KP strains retained susceptibility to fosfomycin in a Chinese university hospital. Of the fosfomycin-resistant KPC-KP, 44 (45.4%) harboring fosA3 and 1 (1.0%) harboring fosA. In a representative fosA3-positive strain KP1034 of the dominant clone, fosA3 was cocarried with blaKPC, blaCTX-M-65, and rmtB on the same plasmid. This study aims to: 1) explore the prevalence of various fos genes in KPC-KP isolates collecting from Ruijin Hospital; 2) clarify characteristics of representative fos-positive plasmids including transferability via broth mating, relatedness of plasmids via fingerprint analysis and replicon typing, fitness cost via growth curve and growth competition experiments, persistence via serial passage; 3) to determine the complete sequence of representative fos-positive plasmids and annotate the sequence with RAST and curate manually using the BLASTn and BLASTp algorithms afterward. Finally to map whole plasmids and to conduct comparisons between closely related plasmids. Further study on fos genes will be helpful for clinical rational use of fosfomycin, and provide clues for the containment of multidrug resistant bacteria.

近年，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌全球流行，磷霉素是治疗这些耐药菌株所致感染的可选药物之一。然而，申请者前期研究发现国内一所教学医院产KPC酶肺炎克雷伯菌（KPC-KP）对磷霉素敏感率仅为43%，主要耐药机制是携带磷霉素修饰酶基因fosA3。进一步研究发现fosA3同多种耐药基因位于同一质粒上共传播。本研究拟：①收集KPC-KP菌株，明确各种fos基因在KPC-KP的分布现状；②分析携带fos基因的质粒生物学特点：通过接合实验明确其可传播性，通过质粒酶切电泳及复制子分型分析质粒相关性，通过竞争实验及生长曲线法明确质粒的适应性代价，最后通过传代法分析质粒稳定性；③通过质粒全序列测定、注解、相关质粒间序列比对等明确fos基因环境以及载体质粒结构特点。旨在阐述fos基因在KPC-KP中的分布情况和传播机制，以及载体质粒的形成、演化及传播机制，为临床防控耐药菌株的产生和播散提供依据。

近年，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌全球流行，磷霉素是治疗这些耐药菌株所致感染的可选药物之一。然而，申请者前期研究发现国内一所教学医院产KPC酶肺炎克雷伯菌（KPC-KP）对磷霉素敏感率仅为43%，主要耐药机制是携带磷霉素修饰酶基因fosA3。进一步研究发现fosA3同多种耐药基因位于同一质粒上共传播。本研究依托瑞金医院继续收集碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP），共收集临床菌株802株，同时收集了国内不同地区12家医院共199株CRKP菌株（聚源菌株）。选取瑞金医院CRKP菌株110株及所有聚源菌株199株。通过16s-RNA测序重新菌种鉴定，最终成功入组100株瑞金菌株及184株聚源菌株。100株瑞金CRKP菌株中73株产KPC酶，12株产NDM酶，其中2株同时产KPC及NDM酶，VIM，IPM及OXA-48皆未检测到。磷霉素耐药菌株共51株，其中39株携带fosA3基因，未检测到其他类型fos基因。184株聚源菌株中166株产KPC酶，3株产NDM酶，1株产VIM，未检测到IPM及OXA-48，磷霉素耐药菌株45株，其中30株产fosA3基因，未检测到其他类型fos基因。根据菌株耐药表型及ST分型选取5株代表菌株，进行接合试验，发现4株菌株中携带fosA3的质粒可以转移到受体菌中，说明其具有水平传播能力。对五株代表菌株抽提携带fosA3基因质粒，行全序列测序，以分析载体质粒的形成、演化及传播机制，目前数据正在分析中。目前研究数据表明我国CRKP菌株耐药机制仍主要为产KPC酶，其对磷霉素仍有较好的敏感性，磷霉素敏感率高达72%，但区域差别较大。瑞金医院CRKP菌株对磷霉素的敏感率较差。CRKP对磷霉素的主要耐药机制为携带fosA3基因，携带fosA3的CRKP菌株主要流行克隆亦为ST11。fosA3基因携带质粒可在菌株间水平传播。