质粒介导产KPC酶大肠埃希菌的克隆流行及传播机制研究

Carbapenem molecules are often the last resort for treating infections due to ESBL-producing E. coli multidrug resistant isolates. Recently, KPC-producing isolates are on the emerging in many places in China. KPC-producing E. coli has been reported in China in 2008. Now in the past few days, we have analyzed three carbapenem-resistant E. coli isolates and found E. coli ST131 with KPC-2 β-lactamase circulating in hospital and the blaKPC gene with different genetic structure were located in plasmids of different sizes. In this study, isolates of KPC-producing E. coli from different areas in China were analyzed. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), S1-PFGE and Multilocus sequence typing (MLST) were used for epidemiological analysis. The genetic structure around blaKPC, the major plasmid incompatibility typing and the identification of β-lactamase gene types were performed by PCR and the positive products were sequenced subsequently. Plasmids harbouring the blaKPC gene were analyzed by transformation,restriction,southern blot and Hiseq 2000 sequencing.

碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）多重耐药大肠埃希菌的首选抗菌药物，但近年来产KPC酶大肠埃希菌在临床的检出率日益增加，给临床抗感染治疗带来极大威胁。在我国，产KPC酶菌株是危害最大的"超级细菌"。本课题组前期对3株产KPC酶大肠埃希菌的研究发现为ST131克隆流行，且blaKPC基因位于大小不同的质粒上。本项目将收集我国不同地区的产KPC酶大肠埃希菌，主要采用MLST、PFGE、PCR、质粒接合及转化、质粒酶切及杂交、质粒不相容分析、S1-PFGE及Hiseq 2000测序技术等分子生物学方法进行菌株同源性、质粒同源性、耐药特性及携带blaKPC基因质粒DNA全序列分析，明确我国产KPC酶大肠埃希菌的克隆流行现状及揭示blaKPC基因在临床快速获得和传播的分子机制，进一步理解基因水平转移的规律，为防控和治疗提供重要依据。

碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）多重耐药大肠埃希菌的首选抗菌药物，但近年来产KPC酶大肠埃希菌在临床的检出率日益增加，给临床抗感染治疗带来极大威胁。在我国，产KPC酶菌株是危害最大的“超级细菌”。本课题组在实验期间收集了宁波两家医院和杭州四家医院共56株碳青霉烯类抗生素非敏感大肠埃希菌，筛选出25株碳青霉烯类抗生素耐药大肠埃希菌，分别来自杭州市中医院、浙江大学医学院附属第一医院、浙江省中医院和浙江省人民医院。为进一步了解产KPC型碳青霉烯酶大肠埃希菌的流行情况和传播机制，加强医院感染控制及防止多重耐药菌大范围播散，本试验主要采用K-B纸片扩散法、MLST、PFGE、PCR、质粒接合及转化、质粒酶切及杂交、S1-PFGE及Hiseq2000测序技术等分子生物学方法进行菌株同源性、质粒同源性、耐药特性及携带blaKPC基因质粒DNA全序列分析。研究发现，25株大肠埃希菌均产KPC酶，编码blaKPC-2基因。这些产KPC酶菌株对抗菌药物的耐药率较高，尤其对几乎所有β-内酰胺类药物耐药。PFGE分型将25株菌株分为3个主要同源克隆群，克隆群A（4株）、克隆群B（5株）和克隆群C（2株），其余14株为散发克隆。MLST分型则分为8个ST型，其中以ST131型为主，共有14株（占56%），另外还包括ST167型3株，ST2003型3株，其余ST型各有1株，这些ST型之间同源性相距较远。PFGE分型和MLST分型结果基本一致。质粒分析发现，在25株产KPC酶大肠埃希菌中，有21株细菌质粒可以通过接合作用转移，受体菌表现出了对碳青霉烯类抗生素的耐药性。经二代高通量测序并拼接分析，发现blaKPC-2基因位于一个大小为15904bp的序列片段上。进一步分析这个15904bp的序列片段，结果发现blaKPC-2基因位于一个典型的Tn3-Tn4401复合转座子中。据以上研究发现，目前我国杭州地区产KPC酶大肠埃希菌以ST131型为主，呈多重耐药性，并且在多家医院检出。耐药菌株的流行具有一定的病区集中性，如ICU、急诊科。blaKPC-2基因位于一个典型的Tn3-Tn4401复合转座子中，这种复合转座子是国内产KPC酶菌株常报道的一种转座子结构，尤其在江浙地区报道的菌株中经常出现，与国外报道blaKPC-2基因周围结构不同。