TLR4siRNA定向作用胰腺纤维化及对胰腺星状细胞功能影响的实验研究

Pancreatic fibrosis is the significant histopathological feature of chronic pancreatitis(CP). Activation of pancreatic stellate cells (PSCs) is the key point for pancreatic fibrosis, while the mechanism is not very clear at present. It has been proved by my prophase research that TLR4 small interference RNA (siRNA) can inhibit cardiac myocyte apoptosis and relieve myocardial interstitial fibrosis in mice induced by streptozotocin（J Transl Med 2010 IF:3.5）, indicating that TLR4siRNA may also inhibit pancreatic fibrosis. Therefore we prepare to construct the TLR4siRNA expression vector and the model of CP rats. Then we will observe the variation law of rat pancreatic fibrosis，PSCs proliferation and each related significant biochemical indicator after TLR4siRNA targeting to PSCs via vitamin A-coupled liposomes (VA-lip-TLR4siRNA). At the same time, we can also investigate the activation of human/rat PSCs, expression level of α-smooth muscle actin and mitogen-activated protein kinase signal pathway, etc by the VA-lip-TLR4siRNA intervention in PSCs, so as to provide the empirical study basis for exploring new gene therapy and intervention target for CP.

胰腺纤维化是慢性胰腺炎（CP）的重要组织病理特征，胰腺星状细胞（PSCs）的激活是胰腺纤维化的关键环节，但作用机制不清。申请者前期研究证实，TLR4小干扰RNA（siRNA）可抑制链脲佐菌素诱导心肌细胞凋亡而减轻心肌间质纤维化（J Transl Med 2010 IF:3.5），提示TLR4siRNA可能对CP胰腺纤维化产生抑制效应。本研究拟构建CP大鼠TLR4siRNA表达载体和大鼠CP模型，观察经维生素A脂质体（VA-lip）转运TLR4siRNA（VA-lip-TLR4siRNA）定向作用大鼠胰腺后，胰腺纤维化、PSCs增殖各项相关重要生化指标的改变规律；同时通过VA-lip-TLR4siRNA干预人/大鼠PSCs体外实验，研究 PSCs的活化、α-平滑肌肌动蛋白及丝裂原活化蛋白激酶信号通路等的表达水平，为探索CP胰腺纤维化PSCs激活机制、以及CP新的基因治疗干预靶点提供实验研究。

在课题的资助下，我们成功建立了慢性胰腺炎小鼠模型，并证实慢性胰腺炎小鼠胰腺组织TLR4表上调；利用生物信息学针对TLR4序列设计并筛选出高效的RNA干扰序列，并建出4个RNAi 表达载体；采用薄膜分散-高压均质法制备出VitA偶联阳离子脂质体，并制备出靶向TLR4的干扰质粒-脂质体复合物VA-lip-shRNA-TLR4；药代动力学结果显示：与正常小鼠相比， VA-lip-shRNA-TLR4在慢性胰腺炎小鼠的胰腺组织中的分布明显增多，同时能够高效干扰胰腺组织中TLR4的表达；慢性胰腺炎小鼠给予VA-lip-shRNA-TLR4治疗后，慢性胰腺炎小鼠胰腺组织病理评分降低，胰腺功能得到部分恢复；同时胰腺组织里I型胶原和III型胶原等纤维结缔组织明显减少，其机制可能与抑制MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达有关，从而减少细胞外基质合成和加速其降解；同时干扰TLR4表达后能减少胰腺组织中α-SMA阳性（活化）的胰腺星状细胞，其机制可能与TLR4表达下调后通过激活线粒体凋亡途径诱导的胰腺星状细胞凋亡，并抑制 TLR4下游NF-κB 信号的激活。同时在课题研究中我们发现VA-lip-shRNA-TLR4在小鼠肝脏中分布较多。慢性胰腺炎所致高血糖常常导致肝纤维化，临床上II型糖尿病患者的肝脏也出现不同程度的纤维化。因此我们探索性的利用VA-lip-shRNA-TLR4治疗慢性肝纤维化小鼠，结果表明：VA-lip-shRNA-TLR4能够逆转小鼠的肝纤维化，降低胶原蛋白在肝脏的沉积，其机理也与干扰小鼠肝脏星状细胞TLR4表达后诱导活化的肝星状细胞凋亡有关，并且能够抑制炎性细胞在肝脏的浸润。