青蒿多糖抗脂筏介导的HCV感染及抑制感染细胞癌变的作用机制研究

To confirm the role of lipid rafts, lipid rafts recruiting proteins and the signaling molecules in HCV infection, reveal the mechanism of Artemisia annua L polysaccharides against HCV infection and the carcinogenesis, this study will verify the relationship between the lipid rafts and HCV infection, find HCV infection related lipid rafts recruiting proteins and signal molecules, reveal the exact mechanisms involved in membrane fusion, draw the HCV infection related lipid rafts protein spectrum and cellular pathways, using protein isoelectric focusing electrophoresis, mass spectrometric analysis，gene chips, co-immunoprecipitation, immunofluorescence localization, adsorption inhibition, gene silencing and western blot methods, on the basis of that the lipid rafts can recruit the proteins of the host and take part in the interaction between HCV and host. Artemisia annua L polysaccharides will be acted on HCV infected embryonic stem cells and liver carcinoma cells, analyze the influence of the polysaccharides on HCV infection by Q-RT-PCR, immunofluorescence, transmission electron microscope, PFU methods. Clarify the relationship of Artemisia annua L polysaccharide and ECRG4 expression level, verify the correlationship between ECRG4 expression, hepatitis C and HCV infection related hepatocellular carcinoma (HCC). Explicit the effects of Artemisia annua L polysaccharide and ECRG4 on cell maturation, cell senility, cell apoptosis, cell cycle, cell proliferation, lipid rafts, lipid rafts recruiting proteins, signal molecules and cell membrane potential,et al。And confirm the results with the liver specimens from hepatitis C patients and HCV positive liver cancer patients.

为证实脂筏、脂筏募集蛋白和信号分子在HCV感染中的作用，揭示青蒿多糖抗HCV感染和感染细胞癌变机制，本研究以脂筏募集宿主蛋白、参与HCV与宿主相互作用为基础，结合蛋白等电聚焦电泳、质谱、芯片、免疫共沉淀、免疫荧光定位、吸附抑制、基因沉默及Western blot等方法，验证脂筏与HCV感染相关性，发现HCV感染相关脂筏募集蛋白和信号分子，揭示其参与膜融合确切机制，绘制HCV感染脂筏相关蛋白谱和细胞通路图。将青蒿多糖作用于感染有HCV的胚胎肝细胞和肝癌细胞, 通过Q-RT-PCR、免疫荧光、透射电镜、PFU实验分析该多糖对HCV感染的影响。阐明青蒿多糖与ECRG4表达的关系，验证ECRG4与丙型肝炎和HCV感染所致肝细胞癌的相关性，明确青蒿多糖和ECRG4对HCV感染细胞成熟、衰老、凋亡、周期、增殖、脂筏、脂筏募集蛋白、信号分子、细胞膜电位的作用。并用丙肝和HCV阳性肝癌患者肝标本加以验证。

全世界现约有1.7亿HCV感染者，并有逐年增高趋势。HCV感染是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要诱因。HCV严重威胁着人类的健康，缩短了人的寿命，死于丙型肝炎的大多数患者的年龄在44-54岁。HCV感染加重了社会负担，美国每年丙肝治疗的费用就达18亿美元。因此丙型肝炎的防治一直备受政府及社会广大科学工作者的极大重视。各国科学家曾对丙型肝炎的防治做了很多有益的尝试，但至今仍未实现真正意义上的防治。目前，聚乙二醇化γ-干扰素与三氮唑核苷联合应用仍是临床公认的治疗丙型肝炎的标准方案，该联合疗法虽提高了丙型肝炎的治疗效果，但因HCV能够通过持续的基因变异、信号干扰、效应分子的调节等复杂过程逃避宿主的免疫反应。此外很多病人不能耐受该联合疗法的副作用及无力支付昂贵的治疗费用等，使得现有的治疗方案仍不能满足治疗的需要。因此，目前急需揭示HCV感染、复制和诱发癌变的机制，开发一些更方便、有效和副作用较少的新药物或疗法，以实现对丙型肝炎的防治。.基于前期研究结果，本课题组对青蒿多糖进一步纯化，使其纯度达98%，并将其作用于HCV感染的胚胎肝细胞和多种肿瘤细胞，通过Q-RT-PCR、免疫荧光、透射电镜实验分析青蒿多糖对HCV复制和表达情况的影响。分析HCV感染脂筏相关蛋白的变化，探讨这些蛋白参与膜融合的确切机制；研究了脂筏介导的细胞信号传导，发现了HCV感染和癌变相关蛋白ECRG4, 明确了脂筏相关蛋白ECRG4抗HCV感染的作用，并在以不同肿瘤细胞作为HCV感染的模型细胞的研究过程中发现了ECRG4在肿瘤发生发展中的不同作用（抗肝癌、抗乳腺癌，但诱发甲状腺癌），绘制了脂筏相关的HCV感染的细胞通路图；明确了青蒿多糖和ECRG4对HCV感染细胞的成熟、衰老、凋亡、周期分布、增殖活性、信号通路、细胞膜电位等的作用。揭示了青蒿多糖抗HCV感染及延缓感染后癌变的作用及机制。本实验为HCV感染机制和治疗新药的研发打下了基础。