狂犬病病毒L蛋白转录酶与复制酶的活性调控研究

Rabies virus (RABV) is a member of the genus Lyssavirus belonging to the family Rhabdoviridae.The polymerase protein of RABV is necessary for viral RNA transcription and replication,because it has the activity of both transcriptase and replicase.It has been demonstrated that RABV gene expression and genome replication is highly regulated to escape the surveilance from host.To fully understand the regulation of activity of polymerase protein transcriptase and replicase, techniques,such as co-immunoprecipitation,Western blot,small RNA deep sequencing and Northern blot, are used to characterize cellular and viral regulators interacted with the polymerase protein.To determine which regulatory factors control the activity of polymerase protein of RABV, RNA interference, construction of cell lines expressing viral and cellular proteins,interactions between polymerase protein and cellular proteins and small RNAs are performed in the present study.Therefore,this study will provide important insights into elucidation of regulatory mechanism of viral genome replication of RABV, and it is also useful for developing anti-rabies target reagent.

狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)为弹状病毒科狂犬病病毒属成员，其聚合酶蛋白（L蛋白）是RABV基因组RNA复制与转录唯一的聚合酶。研究表明，RABV基因表达及基因组复制受到严格调控以逃避宿主的监视。为了深入了解L蛋白转录酶与复制酶的活性调控机制，本研究利用免疫共沉淀、蛋白免疫印迹、小RNA分子深度测序和Northern blot等技术，鉴定与L蛋白相互作用的宿主蛋白及小RNA分子。通过RNA干扰、表达细胞系构建及病毒L蛋白与宿主蛋白和小RNA分子之间的相互作用来分析这些调控因子对L蛋白活性的调控机制。本研究对RABV基因组复制的深入研究有助于开发狂犬病的靶向预防制剂，具有重要的科学意义及理论价值。

狂犬病是由狂犬病病毒引起的重要人兽共患传染病。在我国，狂犬病是一个严重的公共卫生问题。因此，深入阐释狂犬病病毒的复制机理对防治狂犬病具有重要意义。狂犬病病毒是一个具有囊膜的不分节段的单股负链RNA病毒，主要编码核蛋白（N），磷蛋白（P），基质蛋白（M），糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。病毒粒子由外部含有G蛋白和M蛋白的囊膜以及内部N、P、L蛋白和基因组RNA构成的核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein, RNP）组成。RNP所含病毒组分与相应宿主蛋白结合后形成病毒复制复合物以调节病毒复制。..狂犬病病毒粒子在胞内组装时与RNP互作的宿主蛋白也可能被包装入病毒粒子。为了揭示病毒粒子的宿主蛋白组成，本研究利用蔗糖密度梯度离心纯化了狂犬病病毒 SRV9弱毒疫苗株，纯化的病毒粒子经LC-MS/MS检测发现，除了五个病毒结构蛋白以外，病毒粒子还携带有50个宿主蛋白，根据蛋白功能将其分成十类：胞内转运蛋白，分子伴侣，细胞骨架蛋白，信号转导蛋白，转录调节蛋白，钙离子结合蛋白，酶结合蛋白，代谢作用蛋白，泛素化蛋白和其他功能的蛋白。为筛选与N蛋白和P蛋白互作的宿主蛋白，原核表达了重组P蛋白并制备了鼠源多克隆抗体，同时构建了表达狂犬病病毒N蛋白和P蛋白的BHK-21细胞系。免疫荧光试验发现N蛋白主要定位于稳定细胞系的胞核，而P蛋白主要定位于细胞系的胞质，同时稳定细胞系中N和P蛋白表达均能抑制狂犬病病毒的增殖。利用串联亲和纯化TAP从构建的BHK-21细胞系裂解液中分离与N、P蛋白互作的宿主蛋白。LC-MS/MS检测获得了41个和21个分别与N蛋白和P蛋白互作的宿主蛋白。进一步比较狂犬病病毒粒子的蛋白质谱以及与N和P蛋白互作的宿主蛋白发现，8个与N蛋白互作和5个与P蛋白互作的宿主蛋白存在于狂犬病病毒粒子上。与N和P蛋白互作且位于病毒粒子上的宿主蛋白调控病毒复制与感染的机制将是项目后续研究的重点。..本研究首次鉴定了狂犬病病毒粒子的蛋白质组成以及与N和P蛋白互作的宿主蛋白，为进一步研究病毒的复制和感染机制奠定了基础。