香鱼LECT2通过CD209样受体调控巨噬细胞参与抗菌免疫的研究

Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2) is reported to be an important cytokine in vertebrate. Previous studies have shown that LECT2 could activate macrophages to improve the survival of septic mice. However, the functions of LECT2 in fish immune response remain unclear. In this study, we aim to investigate whether LECT2 protects Plecoglossus altivelis against bacterial infection by activating macrophages via the CD209-like receptor. By observing the survival, bacterial killing, tissue pathological section and cytokine expression in infected fish treated with LECT2, we will illustrate whether LECT2 effect is dependent on reducing the exaggerated inflammatory response or improving the protective immunity. By using primary cultured head kidney-derived macrophages, we will investigate the activation effect of LECT2 on macrophages including the alterations of gene expression, cytokine secretion, phagocytosis and bacterial killing to illustrate the cellular mechanism of the immune protection effect of LECT2. By using RNA interference and neutralizing antibody block techniques, we will verify that CD209-like receptor is the functional receptor of LECT2 on macrophages. This work will elaborate the protective mechanism of LECT2 on fish infected with bacteria.

LECT2是一个重要的脊椎动物细胞因子，前期研究揭示哺乳动物LECT2能激活巨噬细胞，提高细菌性败血症小鼠的存活率，鱼类LECT2与其抗菌免疫相关，但功能与作用机理尚不清楚。本项目旨在研究香鱼LECT2是否通过CD209样受体调控巨噬细胞功能，参与整体抗菌免疫能力。拟通过向细菌感染香鱼体内注射LECT2检测存活率、组织载菌量、组织病理和细胞因子表达变化，证实LECT2对香鱼整体的免疫保护作用，解明其作用机制是通过抑制早期炎症或是促进保护性免疫；通过体外细胞培养，研究LECT2处理后香鱼巨噬细胞基因表达、吞噬和杀菌能力变化，证明LECT2激活巨噬细胞功能，解明香鱼LECT2保护性免疫的细胞机理；通过RNA干扰和抗体封闭阻断巨噬细胞CD209样受体，证实CD209样受体介导LECT2激活香鱼巨噬细胞功能。通过项目实施，有望揭示LECT2在鱼类抗菌免疫反应中的保护作用机制。

LECT2是一个重要的脊椎动物细胞因子，与鱼类抗菌免疫相关，但其功能与作用机理尚不清楚。本项目首先采用鳗弧菌感染的脓毒血症香鱼模型，并研究香鱼rPaLECT2m处理对其病情的影响；结果表明，腹腔注射rPaLECT2m能显著改善脓毒血症香鱼的存活率、组织载菌量、早期细胞因子表达和组织病理变化等；利用氯膦酸二钠-脂质体法去除香鱼活体的单核/巨噬细胞（MO/MФ）后，rPaLECT2m的作用消失，揭示MO/MФ是LECT2在香鱼中的靶细胞。其次，我们转录组测序了香鱼头肾来源的MO/MФ，并制备相关基因芯片，采用芯片杂交方法筛选了rPaLECT2m处理后MO/MФ的差异表达基因；结果显示，处理后有231个基因表达上调，14个基因表达下调，这些基因主要为细胞因子及其受体等。进一步我们研究了rPaLECT2m处理对香鱼MO/MФ的活性影响， 发现rPaLECT2m处理可显著增强MO/MФ的呼吸爆发、吞噬和杀菌能力，但不影响其增殖及精氨酸酶活性。最后，采用抗体封闭的方法， 我们阐明了rPaLECT2m是通过其受体—PaCD209a介导激活香鱼MO/MФ； 研究显示，rPaLECT2m处理能显著改变静息和LPS刺激（病理）状态下MO/MФ的细胞因子表达、吞噬及杀菌能力，PaCD209a单独并不介导MO/MФ吞噬，而用anti-PaCD209a IgG封闭PaCD209a功能后，rPaLECT2m诱导的静息和病理态MO/MФ的这些炎症反应受到显著抑制，揭示PaCD209a介导了PaLECT2激活香鱼MO/MФ的过程。综上，PaLECT2可经由PaCD209a介导激活香鱼MO/MФ功能，促进脓毒血症香鱼存活；PaLECT2并不是通过抑制早期炎症反应发挥该作用，而是增强了机体的保护性免疫。本研究在国际上首次系统阐明了LECT2在鱼类细菌性感染免疫应答中的作用及机制，为后续病害的免疫调控防治奠定了理论基础。