潜伏感染期伪狂犬病病毒DNA甲基化图谱测定及功能解析

The project intends to sequence methylation profiles of Pseudorabies virus during latent infection with MeDIP-chip technology (combination of methylated DNA immunoprecipitation with microarray). DNA methylation profiles located within the Replication origin and flanking sequences and IE180/EP0/latency associated transcript (LAT) Transcriptional regulatory regions of Pseudorabies virus during latent infection will be determined and verified by methylation-Specific PCR (MS-PCR). The function of methylation located within the replication and Transcriptional regulatory regions will be determined by measurement of transcriptional changes of methylated genes after treatment with DNA methyltransferase inhibitor of PRV latent pigs in vivo and the detection the function of regulatory regions after treatment with DNA methylase Sss I by useage of Dual-Luciferase reporter gene system in vitro.Proteins which can bind determined methylated DNA regulatory regions will be isolated by electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).The project aims at the determination of methylation profiles of Pseudorabies virus during latent infection and its function on the establishment and maintain of latency. It help to elucidate the mechanism of Pseudorabies latency.

本项目拟通过免疫共沉淀富集甲基化DNA片段结合芯片分析测定伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染期基因组甲基化图谱，并应用甲基特异性的PCR扩增技术，对潜伏感染期和急性感染期与PRV基因组复制与转录起始相关的复制原点及侧翼序列、立早基因IE180和EP0及潜伏相关转录体转录调节区的甲基化图谱进行测定和比较，确定和验证潜伏感染期病毒DNA复制与转录调节相关区域的甲基化图谱。然后，通过体内去甲基化和体外甲基化对转录活性影响试验，测定病毒复制与转录调节相关区域的甲基化对转录的调节作用。最后，通过凝胶迁移滞留试验确定与甲基化位点相关的调控蛋白，研究DNA甲基化调节病毒基因组复制和转录的机制。本项目为研究PRV潜伏感染机制开辟了新的研究思路和途径，为进一步探讨和揭示潜伏感染建立机制奠定基础，为控制和根除PRV感染提供新思路和理论依据。该机理的阐明对于人类疱疹病毒潜伏感染机理的研究和抗病疗亦有借鉴作用。

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)能引起母猪繁殖障碍和新生仔猪脑脊髓炎，是危害养猪业健康发展的重要疫病之一。PRV具有潜伏感染的特性。猪在耐过PRV急性感染后能在体内建立终生潜伏感染，且不表现临床症状。当机体受到应激作用后，潜伏状态的病毒能被激活，引起复发性感染并向外散毒和传播。这种潜伏—激活循环机制决定了PRV在猪群中持续存在。因此，阻止PRV建立潜伏感染和清除体内潜伏感染的病毒对于控制和根除伪狂犬病具有至关重要的作用。但是,目前对PRV建立潜伏感染机理的认识还不清楚。.本项目通过对PRV全基因组甲基化状态进行预测，并采用亚硫酸氢盐PCR测序的方法检测急性期及潜伏感染期极可能与潜伏感染相关的IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域的甲基化状态。结果显示，急性期及潜伏感染期IE180及EP0启动子区及转录起始位点附近区域均存在散在的甲基化位点，并未发现广泛的甲基化区域，与预测结果一致。潜伏感染期间PRV基因组发生甲基化的可能性很小，DNA甲基化在PRV潜伏感染建立和维持过程中没有起到关键作用。宿主组蛋白的表观修饰和microRNA的靶向互补结合在调控基因转录和表达上起重要作用。项目组对宿主组蛋白甲基化与乙酰化修饰在介导猪伪狂犬病病毒潜伏感染中作用研究进行研究，证明PRV部分基因组以染色质结构存在，并对病毒基因组的复制起到抑制作用。测定了PRV感染小鼠脑神经瘤细胞后microRNA表达谱及与潜伏感染相关microRNA功能研究，prv-miR-LLT11a下调猪白细胞抗原Ⅰ类分子SLA-1和抗原递呈相关多肽转运体TAP1的表达来逃避免疫监视及清除的机制，对于揭示病毒潜伏感染状态建立和维持机制奠定基础。.本项目共发表论文7篇，已接受待发表论文2篇；培养硕士研究生6名，青年教师2名。