伪狂犬病病毒编码prv-miR-LLT11a靶向调节SLA-I机制及免疫学效应

Pseudorabies virus (PRV) can establish lifelong latent infection in peripheral nervous ganglion, and persistent infections in peripheral blood lymphocytes by which PRV can escape host immune surveillance and pass through the placental barrier, thereby leading to fetal death and abortion. It is extremely hard to prevent and control pseudorabies due to the special pathogenic and infectious way of PRV. The project focuses on the mechanism of downregulation of swine leukocyte antigen class I (SLA-I) and evasion of CD8+ T cells recogination mediated by Pseudorabies virus encoded PRV-miR-LLT11a based on preliminary study. Firstly, the exact step of SLA-I antigen presentation pathway targeted by PRV-miR-LLT11a will be measured by assaying the kinetics of appearance, internalization, and recycling of surface SLA-I molecules though flow cytometry analysis of PRV-miR-LLT11a transfected Neuro-2a, PK15, and alveolar macrophages. Secondly, the target and mechanism of downregulation of SLA-I by PRV-miR-LLT11a will be determined by the dual-luciferase report system, ubiquitin–proteasomal and lysosomal pathway . Finally, the subversion of PRV-specific CTL response by PRV-miR-LLT11a will be demonstrated by T cell function assay. This project will help to reveal the immune evasion mechanism of pseudorabies virus mediated by microRNA, and lays a foundation to microrRNA-related target therapy.

伪狂犬病病毒能通过逃逸宿主免疫监视，在机体建立潜伏感染，也可在外周血淋巴细胞持续性感染，并藉此突破胎盘屏障，引起胎儿死亡和流产。这种特殊的致病和感染方式导致在生产上防控伪狂犬病难度极大。本项目在前期研究发现PRV编码的prv-miR-LLT11a靶向并下调细胞表面SLA-I基础上，拟应用流式细胞术分析prv-miR-LLT11a靶向抑制SLA-I特征，确定其靶向调控的SLA-I抗原递呈途径的具体环节。然后通过双荧光素酶报告实验、泛素-蛋白酶体和溶酶体蛋白降解途径分析，确定其作用的靶标和抑制SLA-I的机制。最后，通过CTL细胞活性实验检测其抑制SLA-I抗原递呈对CD8+T细胞免疫识别的影响，来探究其介导的伪狂犬病病毒免疫逃逸机制。本项目有助于揭示伪狂犬病病毒免疫逃逸机制，并为以miRNA相关的靶向治疗奠定基础。

猪伪狂犬病是伪狂犬病病毒（PRV）引起的危害养猪业健康发展的重要疫病之一。PRV能逃避机体免疫系统监视和清除，在耐过猪体内建立终生潜伏感染。潜伏状态的病毒能被激活，引起复发性感染并向外散毒和传播。生产上一般采用接种基因缺失标记疫苗配合鉴别诊断方法将野毒感染动物检出并淘汰，因而造成巨大经济损失。阐明PRV免疫逃逸机制对于研发预防、清除潜伏感染和阻止复发性感染的治疗性疫苗具有重要意义。.本项目以PRV YY株为亲本株构建不转录prv-miR-LLT11a的基因缺失株YYΔLAT，利用流式细胞术分析YYΔLAT感染PK-15细胞后不同时间点不同位置SLA I表达量，证明prv-miR-LLT11a可以靶向抑制SLA I的成熟或胞内降解。通过RT-qPCR技术和双荧光素酶报告基因系统证明prv-miR-LLT11a与内质网腔内ER氨基肽酶1/2 3’UTR结合，从而阻碍SLA I成熟，减少细胞表面SLA I蛋白展示。.应用生物信息学筛选可能影响TAP肽转运的PRV蛋白pUL49.5、pUS6和pUL44。研究证明PRV pUS6可以抑制TAP1与ATP的结合使抗原肽的转运缺乏能量，导致与TAP1结合的多肽无法转运到内质网与SLA I分子结合形成复合物，不能被展示到细胞表面，逃避CD8+T分子对感染细胞的识别。.PRV以多种机制干扰SLA I抗原递呈以逃逸免疫系统监视，从而形成潜伏感染。基于此理论，设想将参与免疫逃逸相关的蛋白基因缺失构建的减毒基因缺失株能够被正常抗原递呈，以诱导机体产出更强的免疫应答反应。以同源重组和Cre/LoxP技术构建系列基因缺失株，并对其免疫原性和效力进行评价，发现PRV ΔgE/TK/US3和ΔgE/TK/UL56/US3能诱导更强免疫应答反应，可阻止潜伏感染和复发性感染，是优秀的治疗性疫苗候选株。项目组正申报转基因生物安全评价，并计划申请新兽药。