磷酸化和可变剪切修饰影响Bnip3调控线粒体自噬和细胞凋亡的结构及功能研究

The interaction between Bnip3 and LC3 family members induces mitophagy, which is regulated by the phosphorylation modification on Bnip3. The spliced isoform Bnip3Δex3 can inhibit the pro-apoptotic Bnip3 and is preferentially expressed in several human adenocarcinomas and promotes survival. So far, the 3-D structures of Bnip3、Bnip3Δex3 and their homologues are unavailable. Recently, we have determinated the crystal structure of the complex of phosphopeptide of Bnip3 and LC3B. Besides, we have obtained the crystals of the truncated Bnip3 and LC3B with a resolution up to 3.5Å. In this project we will further refine the complex crystal and try to get the crystals of Bnip3Δex3 as well as Bnip3Δex3-LC3B, and then determine their structures. Based on these structures, on the level of biochemistry and cell biology, we will then engineer a serials of key mutants to elucidate the mechanisms of how the phosphorylation modification on Bnip3 to regulate the interactions between Bnip3 and LC3B to impact the mitophagy, as well as how Bnip3Δex3 to inhibit Bnip3 and then promote the survival of human adenocarcinoma cells. Our study will provide insights into the mechanism of Bnip3 and Bnip3Δex3 regulate mitophagy and apoptosis, and will be helpful for us to better understand the working mechanism of other mitophagy receptors such as Nix and Fundc1 in mammals and ATG32 in yeast.

磷酸化修饰可调节Bnip3与LC3家族成员相互作用介导线粒体自噬。剪切体Bnip3Δex3能抑制促凋亡蛋白Bnip3，促进人多种恶性腺瘤细胞生存。Bnip3、Bnip3Δex3及其同源蛋白的三维结构尚未被报道。最近我们已解出Bnip3磷酸化多肽-LC3B晶体结构，模拟磷酸化Bnip3片段蛋白-LC3B复合物衍射分辨率达3.5Å。本项目将继续优化晶体，尝试获取Bnip3Δex3以及Bnip3Δex3-LC3B的晶体，解析它们结构并基于结构设计关键氨基酸突变体，在生化和细胞水平上阐明磷酸化修饰调控Bnip3与LC3B相互作用介导线粒体自噬，以及Bnip3Δex3抑制Bnip3促进恶性腺瘤细胞生存的分子机理。研究结果将加深对Bnip3、Bnip3Δex3在线粒体自噬和细胞凋亡两个方面的理解，为其它哺乳动物线粒体自噬受体、酵母Atg32介导线粒体自噬的研究提供指导。

磷酸化修饰可调节Bnip3与LC3家族成员相互作用介导线粒体自噬。剪切体Bnip3Δex3能抑制促凋亡Bnip3蛋白，促进人多种恶性腺瘤细胞生存。本项目研究得到一下成果：（1）得到了多个高纯度Bnip3片段蛋白。已获得磷酸化Bnip3磷酸化多肽与LC3B蛋白的复合物晶体，并成功解析了其三维空间结构，目前文章已经撰写中，等文章投稿后才将三维空间结构文件存入国际蛋白质晶体数据库PDB中。（2）测定了不同Bnip3磷酸化位点修饰对Bnip3与LC3B相互作用的影响差异，根据三维空间结构信息，阐明了磷酸化修饰调控的机制。已获得了多种条件下Bnip3片段蛋白和LC3B的复合物微小晶体，进行了大量的晶体的优化并获得分辨率较低的衍射花样图。为了优化Bnip3-LC3B蛋白复合体的晶体分辨力，我们尝试了多种方法。（3）通过原核表达和纯化技术，获得的Bnip3Δex3基因片段编码的蛋白质，筛选Bnip3Δex3以及Bnip3Δex3-LC3B复合物单晶，目前还在进一步优化晶体和进行相关细胞生化实验。（4）本项目在研期间，已发表了3 篇sci论文（影响因子分别为：5.06，3.5，2.9）（见附件），并在国内期刊上发表6篇论文，还有很多的关键的实验结果正在整理投稿之中，这些论文均标注本项目基金号。在本项目期间，项目负责人联合招生培养4名儿科硕士学生，独立招生培养2名儿科硕士学生。派出8人次（项目负责人及项目负责人招生培养的儿科硕士研究生）参加相关的学习和培训会议，提升专业知识和技能。研究结果将加深对Bnip3、Bnip3Δex3在线粒体自噬和细胞凋亡两个方面的理解，为其它哺乳动物线粒体自噬受体、酵母Atg32介导线粒体自噬的研究提供指导。