BNIP3泛素化及其对低氧引起的线粒体自噬的调控作用

Mitophagy is recently found a new self-regulation function of cell in scavenging redundant reactive oxygen species (ROS) through specific degradation of damaged mitochondria. BNIP3 is a mitophagy marker, which can specifically activate mitophagy. However, the present researches focus on the role of expression of BNIP3 in activating mitophagy. It is unknown that the role of posttranslational modification of BNIP3 in regulating mitophagy. According to the reports, phosphorylation and glycosylation are the only two posttranslational modifications of BNIP3 up to now. In our hypoxia experiments, we found that BNIP3 could be degradated by ubiquitination pathway. If this phenomenon is verified, it will be the third posttranslational modification of BNIP3. Additionally, we noticed that different hypoxia caused different mitophagy, and presumed that BNIP3 ubiquitination might mediate the effect of hypoxia on mitophagy. In order to clarify these questions, in this project we will proceed to confirm the BNIP3 ubiquitination, and explore the regulatory role of BNIP3 ubiquitination in hypoxia-induced mitophagy. Through this project, we try to increase the new contents for mitophagy research.

线粒体自噬是近年新发现的能通过特异性降解受损线粒体清除体内过多活性氧的一种细胞自我调节功能。BNIP3是线粒体自噬的标记分子，能特异激活线粒体自噬的发生。目前报道的BNIP3对线粒体自噬的激活作用主要局限于BNIP3蛋白表达上，BNIP3翻译后修饰是否参与对线粒体自噬的调控还不清楚。磷酸化和糖基化是现在仅知的两种BNIP3翻译后修饰形式。我们在低氧实验中检测到BNIP3可以发生泛素化降解。如果被确证这将是BNIP3被发现的第三种翻译后修饰。另外我们还发现，不同低氧条件下线粒体自噬程度不同，我们推测BNIP3泛素化可能参与介导了低氧对线粒体自噬的调节。为阐明这些问题，本项目将从确证BNIP3泛素化入手，深入研究BNIP3泛素化与低氧引起的线粒体自噬的关系，为线粒体自噬研究注入新的内容。

BNIP3是一种线粒体外膜蛋白，属于Bcl-2家族BH3-only成员。同时，BNIP3是低氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)的靶基因，在低氧时能被HIF-1转录激活，使BNIP3表达高度上调。BNIP3的功能涉及相反的两方面：一方面是诱导细胞凋亡或坏死，起到促死亡作用；另一方面，也是近年研究的热点，即引起自噬或线粒体自噬，起到促存活作用。但至今尚未解决的问题是BNIP3在何种情况下通过自噬或线粒体自噬途径促进细胞存活，以及在何种情况下通过凋亡或坏死途径导致细胞死亡，是否存在一种修饰开关来决定该蛋白在不同情况下的走向。本项目研究揭示，BNIP3这两种途径的选择与不同程度低氧所导致的蛋白翻译后修饰密切相关：适度低氧下BNIP3磷酸化水平的增加有利于促进自噬和线粒体自噬，而严重低氧下BNIP3泛素化水平的增加则是诱导细胞凋亡的重要信号。.本研究首先用两种氧含量（10% 和0.3% O2）处理PC12细胞，发现在相同时间低氧后，适度低氧（10% O2，24 h）促进了自噬和线粒体自噬的发生，同时细胞凋亡受到抑制；相反，严重低氧（0.3% O2，24 h）阻止了自噬和线粒体自噬，细胞凋亡加剧。同样情况发生在同一氧含量（0.3% O2）的不同处理时间上。通过位点突变检验BNIP3磷酸化和泛素化水平的改变，我们证实S60和T66位点磷酸化能增强BNIP3诱导自噬/线粒体自噬，而这两个位点的去磷酸化或不被磷酸化是导致BNIP3发生泛素化降解的关键。.因此，根据本研究我们提出，在适度低氧条件下BNIP3 S60和T66位点被磷酸化激活，促进BNIP3对自噬和线粒体自噬的诱导作用，有利于细胞在该低氧条件下的存活；在严重低氧条件下BNIP3 S60和T66位点发生去磷酸化，或者不能被磷酸化，进而引起泛素酶连接酶E3的识别与泛素的积累，导致BNIP3被泛素化降解，自噬与线粒体自噬受阻，在该低氧条件下细胞最终通过凋亡或坏死走向死亡。.本研究对于临床治疗相关疾病，如神经退行性疾病和癌症，提供了非常好的双向干预靶点。