甘氨酸自由基酶YjjI在DNA修复中作用及其酶促反应机理研究

Many anaerobic bacteria are human pathogens, containing YjjI, a glycyl-radical-enzyme-like protein. This suggests that YjjI is critical for bacterial anaerobic growth. However, the YjjI-catalyzed chemical reaction remains to be characterized. Our preliminary data suggests that YjjI plays an important role in DNA repair, more specifically, the dealkylation of methylglyoxal-mediated DNA adducts. Glycyl radical enzymes (GRE) require radical S-adenosylmethionine (SAM)-containing activating enzymes to generate their glycyl radicals. This involves electron transfer from Fe-S cluster to SAM followed by the cleavage of the SAM cofactor and the formation of a deoxyadenosyl radical. We have successfully cloned, expressed, and purified E. coli YjjI and its activating enzyme YjjW. Furthermore, using bicine and acriflavin as electron donors, we were able to reconstitute active glycyl radical containing YjjI. This is the first experimental demonstration of YjjI being a GRE. We propose to further characterize YjjI-catalyzed chemical reaction and to measure the reaction constants by developing an aldehyde dehydrogenase coupling assay and an isotopic labeling assay followed by HPLC and LC-MS/MS. We will also investigate the catalytic mechanism using various approaches such as measuring isotopic effects, using competitive substrate analogues, trapping reaction intermediates and using site-directed enzyme mutants. This proposal may provide revenues to new antibiotics against anaerobic bacteria.

厌氧菌引发人类疾病，其特有的甘氨酸自由基酶与其致病力密切相关。 YjjI是未被证实且功能未知的甘氨酸自由基酶。课题组前期研究表明其很可能修复烷基化的DNA衍生物，从而保证遗传信息的正确复制和表达。自由基通常寿命极短，而自由基酶独特的结构微环境却能保持其相对稳定，因此重组稳定自由基是研究此类酶的关键和难点。课题组已成功克隆表达纯化了YjjI和其辅酶YjjW，并用光电传导还原YjjW的铁硫簇和S-腺苷甲硫氨酸，形成脱氧腺苷自由基，用于氧化YjjI C末端的保守甘氨酸残基，形成稳定自由基。在此重要实验结果的基础上，课题组拟通过醛脱氢酶偶联、同位素底物标记结合层析和质谱技术检测反应产物，来证实YjjI催化DNA去烷基化，进而测量各反应常数；拟通过同位素效应，底物类似物，酶反应中间产物和酶活性中心的定点突变来探索其催化机理和在细胞内的功能，从而为开发针对厌氧细菌的新型抗生素提供理论和实验基础。

课题组严格按照项目申请书的实验设计方案，对YjjI这个未知功能的甘氨酸自由基酶开展了全面的研究。总体上我们执行了项目书提到的所有实验。积累了大量的实验数据，包括极为重要的YjjI的蛋白晶体结构。在研究YjjI的同时，我们发现了两个新的甘氨酸自由基酶，并做了大量的工作，这两个新酶，一个是吲哚乙酸脱羧酶，另外一个是羟乙磺酸裂解酶（我们分别命名为IAD和IseG）。相关的工作均发表在自然子刊Nature Communications上。在此基础上，我们发现了肠道菌以及环境菌的多条牛磺酸和羟乙磺酸代谢通路。有的菌从中获得C，有的获得N，有的获得S，有的获得能量。相关的酶很多为第一次发现的新酶，我们也研究了它们的结构、酶动力学、以及催化机制，论文分别发表在Biochemical Journal, Applied & Environmental Microbiology, Bioscience Reports 等主流学术期刊。由于牛磺酸的结构与β丙氨酸很相似。我们进而发现了嘧啶还原型降解通路的产物β丙氨酸，并不是一直以来以为的终产物。细菌可以通过我们发现的新酶，把β 丙氨酸通过转氨酶和还原酶，继续降解，从而摄取残留在β丙氨酸上的嘧啶的N。论文发表在Journal of Biological Chemistry。因此，我们超额地完成了项目书提到的所有三个研究目标： 1发现酶促新反应； 2了解厌氧生物生存的机制； 3为开发专门针对厌氧细菌的新型抗生素提供靶点和理论实验基础。本基金支持下的其它重要工作：利用非核糖体多肽合成酶获得人类历史上第一朵蓝玫瑰；甘氨酸自由基酶活检测需要用到的偶联酶甘油脱氢酶的结构解析和生化研究；利用功程改造的酵母作为底盘，导入植物来源基因编码的酶，合成生物学方法首次全生物合成具有高价值的药用和工业用萜类化合物，檀香油；建立新的酶活检测方法，检测铁和酮戊二酸依赖加双加氧酶和萜类合成酶的活性。在本基金的支持下总共发表SCI论文13篇，获得授权专利3项，已申请并进入实审专利2项，PCT一项。培养了两名博士后、两名博士生和七名硕士研究生。工作成果受到全球媒体的广泛关注和专题报道。具有应用价值的知识产权目前正在与企业洽谈授权、转让。