miR-34a在骨肉瘤细胞去分化过程中的调控作用及相关机制研究

In the previous studies, we found that TGF-β1 signaling dramatically down-regulated miR-34a expression, and induced self-renewal capacity in non-stem osteosarcoma cells, which in turn promoted chemo-resistance, tumorigenicity, neovasculogenesis and metastatic potential. For further uncover regulatory mechanism of miR-34a in the process of dedifferentiation, we will analyze the impact of TGF- β 1 signaling on the expression of miR-34a, screen potential transcription factors in TGF- β 1 signal pathway, which targets miR-34a directly and represses miR-34a expression. Confirm the effect of miR-34a on the dedifferentiation and osteosarcoma cell phenotype. Identificate and characterize downstream target genes of miR-34a, and explore the possibility that miR-34a could act as mediator of changes in the osteosarcoma microenvironment during tumor progression and metastasis. The present study will provide the critical experimental evidence on the important role of miR-34a in the process of dedifferentiation in osteosarcoma. The results could shed light on molecule-target therapy for the patients with osteosarcoma.

前期研究中我们发现，骨肉瘤微环境中的TGF-β1可以下调miR-34a的表达，并使骨肉瘤细胞去分化获得干细胞特性。去分化的细胞比成熟的骨肉瘤细胞具有更强的侵袭力和转移力,高度耐受化疗并具有多向分化潜能。为进一步研究在骨肉瘤细胞去分化过程中miR-34a的调控作用和相关机制，我们拟开展以下研究工作：1，通过分析TGF-β1信号通路对miR-34a表达的影响，筛选调控miR-34a转录的候选基因，从而明确TGF-β1下调miR-34a表达的分子机制。 2，分析miR-34a对骨肉瘤细胞表型的影响，明确miR-34a对去分化的调控作用。3，鉴定miR-34a的靶分子，通过分析miR-34a靶分子及其信号通路对骨肉瘤细胞表型的影响，阐明miR-34a靶分子对去分化的调控机理。研究结果将进一步揭示微环境对骨肉瘤发生发展的调控作用，并为肿瘤细胞去分化和骨肉瘤的靶向治疗研究提供重要的工作基础。

骨肉瘤是一种多发于儿童和青少年中的恶性骨肿瘤，其局部侵袭性强，极易发生血行性转移，病情进展非常迅速，病死率相当高，预后极差。因此，深入研究骨肉瘤发生发展和转移的分子机制，寻找治疗骨肉瘤的新靶点，才有望减少骨肉瘤治疗中存在的问题。前期工作发现，骨肉瘤细胞处于一个富含TGFβ1和低氧的微环境中，二者通过诱导成熟的骨肉瘤细胞去分化获得骨肉瘤干细胞特性，同时具有分化成脂肪细胞的能力，并显著促进骨肉瘤干细胞转分化成血管内皮细胞，促进肿瘤细胞的远处转移。但骨肉瘤去分化过程中的分子调控机制还有待研究。如今骨肉瘤的病因研究主要集中在异常调节的致癌基因、抑癌基因和多耐药基因。TP53基因是人体内主要的抑癌基因，其突变会导致细胞失去抗血管生成活性和对细胞分裂的控制，从而促进骨肉瘤发生发展，与骨肉瘤的不良预后息息相关。miR-34a是一种关键的抑癌分子，受TP53的直接调控，并通过抑制特殊靶基因的表达来介导p53的下游效应。同时，miR-34a可以通过调控p53的上游元件起到间接激活TP53的作用。有报道称，在iPS形成过程中，miR-34a呈p53依赖性上调，miR-34a的上调能阻碍iPS的进程，敲除miR-34a则可以显著提高iPS的效率。他们的成果提示，miR-34a在细胞去分化过程中扮演着十分重要的角色。本研究主要选取了MNNG/HOS，MG-63和U-2 OS三种骨肉瘤细胞系进行观察研究，分析骨肉瘤微环境对miR-34a-5p表达的影响；解析miR-34a-5p及其靶分子对骨肉瘤细胞去分化过程的调控，试图阐明TGFβ1诱导骨肉瘤细胞去分化的过程中miR-34a-5p及其相关分子网络的调控作用。.结果表明，miR-34a在骨肉瘤的去分化过程中显著上调，过表达miR-34a可以有效抑制骨肉瘤的去分化，而抑制miR-34a可以促进这一过程。此外，本研究解析了miR-34a的下游靶向PAI-1–Sox2调控通路对骨肉瘤去分化的重要调控作用，并通过骨脱细胞外基质模型重构骨支架，再现了骨肉瘤患者体内高异质性的现象，验证了体外细胞模型得到的结果。研究结果将进一步揭示微环境对骨肉瘤的发生发展的调控机制，并为肿瘤细胞去分化的研究和骨肉瘤的治疗研究提供重要的工作基础。