利用iPSCs来源的人晶状体蛋白基因组学探索先天性白内障新基因的定位及病理机制

More than 20 mutations related to congenital cataracts have been found and reported by our group over the past decade. To further explore the novel genes and novel mutations causing congenital cataracts, proteogenomics of patient-specific regenerated lens was introduced into our project. Urinary derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) from the patients were first differentiated into regenerated lens which showed similar characteristics to patient opacity lens using our newly developed “fried egg” method. Molecular mechanisms were then explored using techniques such as whole genome sequencing, protein mass spectrometry, iTRAQ, siRNA assay, CRISPR-CAS9, transfection and et al, as well as some cellular cataract models. The patient-specific cataract model generated in this project not only retained the patient’s genetic background, but also mimicked the cataract progression, therefore, played a vital role in our study. Exploration may lead to clinical opportunities for gene repair and stem cells therapy in congenital cataracts.

申请人前期研究已发现20多个可致先天性白内障（先白）的基因突变。为了进一步寻找先白的新基因新突变，探索可能的病理机制，申请人从蛋白基因组学的角度，利用病人特异性白内障疾病模型即利用申请人近期创立的“荷包蛋”法将病人尿液细胞来源的iPSCs体外诱导成与病人晶状体类似的混浊再生晶状体，结合全基因组测序、蛋白质谱分析、siRNA干扰、CRISPR-CAS9技术、质粒转染等，并结合细胞模型在基因组学、蛋白组学两个层面从全新的视角探寻未知突变家系的新基因新突变并研究其分子机制。本课题采用的病人特异性白内障疾病模型不仅保留了病人特异性的遗传背景，而且还模拟了白内障发病进程，为本课题的实施提供了可能性。研究成果将为先白突变基因修复、再生晶体及干细胞治疗提供理论基础。

先天性白内障是儿童首位致盲性眼病，其中30%和遗传相关。本课题基于蛋白基因组学，针对临床发现的先天性白内障突变家系，利用患者特异性白内障疾病模型即利用申请人近期创立的“荷包蛋”法将病人尿液细胞来源的iPSCs体外诱导成与病人晶状体类似的混浊再生晶状体，首次发现核转运蛋白4 （KPNA1）突变（T103K）可能引起先白，进而一方面通过CRISPR-Cas9技术，评估KPNA1基因敲除及T103K突变对人晶状体上皮细胞（hLEC）生长、增殖、细胞迁移、衰老、凋亡、自噬的影响，同时利用RT-PCR检测KPNA1同系物的基因表达情况；另一方面，通过对Kpna1基因杂合子小鼠进行繁殖获得子代并进行基因型鉴定，观察各个基因型小鼠眼球尤其是晶状体的发育情况，深入阐明了KPNA1突变引起先白发生发展的分子机制。细胞实验结果显示，在正常培养条件下，KPNA1基因敲除和T103K突变对hLEC的生长、增殖、细胞迁移均没有明显影响，但会加速细胞衰老和凋亡，且对氧化应激的耐受能力下降。KPNA1基因敲除后，同系物KPNA2表达升高，可能存在代偿机制。T103K突变型hLEC自噬受抑，且KPNA1蛋白定位发生异常，导致核质转运异常。动物实验结果显示，Kpna1基因敲除会影响小鼠晶状体的微观结构，导致晶状体核的退化延迟，内部空泡形成，晶状体混浊时间提前、程度加重，在紫外线照射处理下更易产生晶状体混浊，提示Kpna1对于维持小鼠晶状体透明度至关重要。本研究首次利用病人特异性先白疾病模型，发现了KPNA1基因T103K突变是潜在的先白致病突变，并阐明了其引起白内障发生发展的相关机制，为今后先白突变基因修复、再生晶体及干细胞治疗提供理论基础。