层状多肽薄膜的组装及其对骨髓间充质干细胞行为的调控研究

本项目拟采用层层组装技术制备由聚赖氨酸和聚谷氨酸、透明质酸、明胶等组成的一系列多层膜，并考察它们对干细胞的粘附、增殖与分化等生物学行为的调控性能。研究内容可概括为：首先，制备多肽多层膜，通过"点击反应"引入RGD肽段以促进细胞粘附；其次，包埋骨形态发生蛋白-2（BMP-2）于多层膜内，调控其有效包埋量；最后，种植骨髓间充质干细胞，重点考察在膜表面BMP-2对干细胞的诱导分化，并鉴定分化细胞。通过上述实验设计，旨在观察RGD肽段对膜表面性能的改善、BMP-2在膜内的包埋及BMP-2对骨髓间充质干细胞的诱导分化等现象，探讨层层组装薄膜调控干细胞分化的机制，解决人造材料非特异性作用和生命体特异性作用的矛盾，实现材料和生命体的生物相容和功能诱导，为研制具有细胞粘附能力和高效诱导效应的新型薄膜材料提供实验依据和新的解决途径。

本项目利用分子层层自组装技术构建了由聚赖氨酸等多肽组成的薄膜以及多肽与纳米材料复合薄膜，系统地测试了薄膜材料的表面性质、溶胀性、机械强度等物理化学性能，进而考察了该类薄膜的细胞相容性，特别是对动物细胞粘附与增殖行为以及干细胞定向分化行为的调控等。研究表明，由层层组装技术制备的多肽薄膜其表面性质、溶胀性质和机械性能可方便地通过改变组装条件加以调控，例如：借助“点击反应”技术对薄膜表面进行了RGD肽功能化，通过识别细胞表面的整合素，明显促进了细胞粘附；通过改变组装时的离子强度实现了对薄膜溶胀性能的调控，发现当组装溶液离子强度较低时（0.15 M NaCl或无盐），所得薄膜在细胞培养液中溶胀性较低，或基本不溶胀，反之，则较高，其溶胀范围最高可达近400%；另外，通过在组装过程中引入纳米材料（氧化石墨烯纳米片，纳米粒子），大大改善了多肽薄膜的机械强度，得到的纳米复合薄膜相对传统多层薄膜无论弹性模量还是硬度均有了较大的提高，特别是当氧化石墨烯与聚合物相同层数组装时，其弹性模量相对纯聚合物膜增加近5倍，而硬度则提高近10倍。进一步地，通过细胞实验证明了薄膜材料上述性能的变化可显著影响细胞的粘附、增殖以及干细胞定向分化等行为。例如，小鼠胚胎成纤维细胞对于溶胀性差、机械强度高的薄膜表现了较高的亲和性，反之，亲和性差。更重要地，上述纳米复合薄膜可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，同时，以此方法制备的多层薄膜具有较高的吸附性能，能吸附固定细胞生长因子（如骨形成蛋白BMP-2），并保持其生物活性，对于骨髓间充质干细胞成骨行为呈现了显著的促进作用，表现了优良的细胞调控性能。最后，考察了薄膜材料的生物降解性和刺激响应性，通过制备生物酶可降解的肝素钠载体，以及响应葡萄糖的胰岛素载体，进一步验证了多功能生物活性薄膜材料的制备可行性。通过系统的项目研究，在多功能薄膜材料的制备及其用于细胞与干细胞行为的调控方面取得了一系列创新性研究成果，部分成果已在J Mater Chem B, Colloid Surface A，J Biomed Mater Res A等学术期刊上发表，并得到了同行的普遍关注（其它成果等待发表）。本项目获得的研究成果，为研制具有良好细胞粘附能力和高效诱导效应的薄膜材料提出了新的途径，特别是对于实现材料和生命体的生物相容以及功能诱导提供了重要的理论依据。