汉坦病毒多组分新型重组腺病毒的制备及免疫学特性研究

肾综合征出血热由汉坦病毒引起，目前尚缺乏特异有效的防治方法。本课题组曾对汉坦病毒核蛋白与糖蛋白不同片段融合基因的构建、表达及其刺激机体免疫应答的能力等进行了较为深入的研究。本项目拟在前期工作的基础上，以复制缺陷型腺病毒Adeno-X系统为基础，利用基因重组技术，将腺病毒转移载体的启动子替换为高效启动子CAG，以提高目的基因的表达水平；在此基础上进一步构建含汉坦病毒M、S基因双顺反子的腺病毒表达载体，并联合应用抗原加工分子基因- - 泛素，以在原有基础上进一步提高目的基因的表达水平并促进抗原的加工和提呈。同时对这些重组腺病毒的免疫学特性进行系统比较研究，以期达到汉坦病毒不同结构蛋白在刺激机体免疫应答能力中的优势互补，特别是进一步提高刺激体液以及细胞免疫应答的能力。本项目的完成将可能为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供新的候选疫苗株，这对于防治HFRS这一危害极为严重的传染病具有重要的理论和实际意义。

肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）由汉坦病毒引起，是我国危害最严重的急性传染病之一。目前我国已研制成功HFRS灭活疫苗，其推广使用对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用。但该类疫苗仍存在一些问题。因此，研发新型的HFRS疫苗将有助于进一步提高我国对HFRS的防控水平。. 本研究在本实验室前期采用CAG启动子及HSP70C分子佐剂的基础上，考虑到汉坦病毒GP的表位为空间构象依赖，将GP与NP融合表达可能会影响其空间构型，从而影响到免疫原性，因此本研究使用脑心肌炎病毒内核糖体进入位点（ECMV IRES）将GP、NP在同一腺病毒中分别表达，从而更有利于保持其免疫学活性。. 我们构建了可分别表达汉坦病毒汉滩型（HTNV） GP、NP及HSP70C的重组腺病毒载体，转染HEK293A细胞后，获得了8株重组腺病毒，将重组病毒感染HEK293A细胞，免疫荧光检测结果显示，所有重组腺病毒均可表达目的蛋白。将上述各重组腺病毒通过腹腔途径免疫C57BL/6小鼠。通过ELISA及微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。结果显示，各重组腺病毒均可刺激小鼠产生针对HTNV GP、NP的特异性抗体及中和抗体，且添加HSP70C的各重组腺病毒免疫组抗体的几何平均滴度（GMT）均高于对应的未添加组；CTL杀伤实验及ELISPOT检测的结果表明融合HSP70C的重组腺病毒能更好的诱导机体的细胞免疫应答。用HTNV 76-118株攻击各重组腺病毒免疫的小鼠，采用ELISA及RT-PCR对感染小鼠的部分脏器进行检测，结果显示， rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫组及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫组小鼠的HTNV抗原及核酸含量均为最低，且与灭活疫苗组无显著差别，表明其保护效果与疫苗组相当。本研究的一系列体内外实验的结果表明，采用将HTNV GP和NP分别与HSP70C融合，并用IRES将两种融合蛋白分别表达的策略构建的重组腺病毒，其诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的能力均得到了提升；且构建的重组腺病毒诱导的免疫应答在多数指标上均优于灭活疫苗或与之相同；此策略构建的重组腺病毒在诱导体液免疫应答方面更具优势。本研究为HFRS新型疫苗的研制提供理论、实验和物质基础。