典型抗生素对地下水系统中反硝化过程的影响机理研究

The microbial denitrification process is the most important form of nitrate-nitrogen removal in subsurface. The reclaimed water reuse and livestock breeding caused antibiotic pollution usually co-occurrence with nitrate. Therefore, the influence of denitrification by the existence form of antibiotics and ARGs (Antibiotics Resistance Genes) in groundwater should be highly concerned. In this study, the most typical antibiotics (sulfapyridine, oxytetracycline, erythromycin, norfloxacin and lincomycin) are selected as the objective contaminants. Batch experiment is conducted to study the existing form of antibiotics after entering the groundwater system. During the denitrification kinetic processes, the influence of antibiotics on the species and activities of the denitrification enzyme is investigated by the qualitative and quantitative capability of HPLC-TOF-MS and high performance liquid chromatography-ICP-MS. High-throughput technology such as RNA-seq is used to explore the dynamic process of denitrification functional gene and ARGs under the influence of the antibiotics’ different existing forms and input modes. The combination of field investigation and laboratory experiment will be performed. By setting up a series of field observation of denitrification process and laboratory simulation column experiments, the influence mechanism of the typical antibiotics on denitrification ability and process will be clarified according to the following aspects: hydrogeochemistry (change of pollutant concentration and water chemistry parameter), microbial community (structure, evolution), denitrification enzyme (type, activity), denitrification functional gene (abundance, diversity) and ARGs (emerge, enrichment, dissemination).

微生物反硝化过程是地下水中硝酸盐最重要的脱氮形式，再生水利用和养殖业引起的抗生素污染常与硝酸盐共存，抗生素存在形式对地下水中硝酸盐反硝化过程及抗性基因产生、富集和传播的影响备受关注。本研究以典型抗生素(磺胺吡啶、土霉素、红霉素、诺氟沙星和林可霉素)为研究对象，利用批试验研究抗生素在地下水系统的存在形式；借助HPLC-TOF-MS、HPLC-ICP-MS的定性和定量能力，厘清反硝化动力学过程中抗生素存在形式对反硝化酶种类和活性的影响；凭借RNA-seq等手段探索反硝化功能基因在抗生素不同存在形式和不同输入方式下的变化过程，并建立抗性基因产生、富集与传播模式。采用野外观测和室内实验相结合的方法，从水文地球化学（污染物浓度、水化学参数）和分子生物学（群落结构、反硝化酶种类和活性、反硝化功能基因丰度和多样性、抗性基因产生、富集和传播）不同的视角综合理解典型抗生素对地下水系统反硝化过程内在影响机制。

微生物反硝化过程是地下水中硝酸盐最重要的脱氮形式，再生水利用和养殖业引起的抗生素污染常与硝酸盐共存。项目从建立方法体系入手，在解析抗生素存在形式和环境行为基础上研究单一和复合抗生素对反硝化过程的影响机理，结合研究区检出状况模拟反硝化过程对抗生素不同输入方式的响应，并系统开展了场地尺度抗生素对反硝化影响的时空规律研究。取得主要成果如下：（1）构建了考虑检出频数的优先控制抗生素识别新方法，形成了优先控制抗生素清单，创建了地下水中189种典型药物的定性谱库，实现了抗生素的定性识别；建立了64种典型抗生素SPE-UPLC-MS/MS定量方法。（2）基于宏基因组数据分析平台识别了反硝化功能基因，构建了针对研究区的抗性基因和反硝化功能基因的高通量qPCR芯片；发现了微生物对抗生素指示作用和响应机制，揭示了地下水中抗性基因的转播机制及影响因素。（3）形成了典型抗生素转化产物识别方法，识别了林可霉素的18种转化产物；获得了典型抗生素的水解动力学参数；揭示了针铁矿、赤铁矿、水钠锰矿、有机质（天然和人工）和粘土矿物与抗生素的相互作用机制，发现共存金属离子、pH、矿物团聚及有机质的表面性质均可影响抗生素的吸附特征，厘清了不同形态抗生素环境行为的差异。（4）从酶、基因组和转录组水平揭示了抗生素类型、浓度和输入方式对反硝化过程的影响机制，发现抗生素存在下硝酸盐降解的动力学特征受反硝化酶差异性表达控制以及抗生素对反硝化过程影响的浓度效应与机制。（5）通过系统的野外观测，从时空尺度理解了ng/L复合抗生素影响下地下水的反硝化过程，发现反硝化速率与低浓度复合抗生素的总浓度变化成正比，揭示了反硝化细菌对低浓度复合抗生素选择压力变化的响应机制。项目从多尺度、多视角研究复合抗生素污染下地下水系统的反硝化过程，有助于理解地下水系统硝酸盐氮浓度日益升高的原因，为复杂的地下水污染防治和饮用水安全保障提供理论依据。