卵母细胞减数分裂过程的三维超分辨成像与分子动态追踪研究

The abnormality of oocyte meiosis is one of the main reasons for congenital malformations and pregnancy failure, which involves the synergistic dysfunctions of multiple molecules. However, the inherent properties of optical imaging methods, such as poor spacial resolution and small depth of field, impedes researchers to visualize such complex dynamic process. Thus, we will study and establish a large depth of field, 3-dimensional dynamic super-resolution fluorescence microscopic imaging system to study the oocyte meiosis. The excitation by sheet light and the localization by extended large depth of field technique will be applied. The 3D super-resolution images of spindles constructed by microtubule protein during oocyte meiosis will be obtained. At the same time, the dynamic tracking and localization of 3 key proteins, motor protein dynein, and spindle assembly checkpoint proteins Mad (mitotic arrest deficient) and Bub (budding uninhibited by benzimidazole), will be recorded by using the same system. The conventional biochemical assays will also be performed and the quantitive information will be acquired for analyzing the oocyte meiosis. The distribution, motion and interaction of these proteins during the oocyte meiosis will be studied. The temporal and spacial regulation mechanism of these proteins for fine separation of homologous chromosome will be explored. The mechanism of the aneuploidy occurrence will be deduced. The achievement of the project will provide a novel method for studying on the real-time dynamics of multiple molecules in living cell, which has an important academic value for illustrating the oocyte meiosis involving multiple molecules, as well as has a great social significance for preventing and controlling the aneuploidy aberration, and reducing the birth defects has great social significance.

卵母细胞减数分裂异常是新生儿先天畸形和妊娠失败的主要原因之一，该过程涉及多种蛋白分子协同作用。但受现有成像方法空间分辨率低、景深小等因素限制，目前还无法对这一复杂动态过程进行实时成像。针对此现状，本项目将研究并建立一套大景深三维动态纳米分辨显微成像系统，利用片状光激发和大景深分子定位技术，同时获取卵母细胞减数分裂过程中微管蛋白缓变结构的三维超分辨图像，及动力蛋白Dynein、纺锤体检验点蛋白Mad和Bub的三维动态分子定位信息。结合传统生化分析结果，研究这四种关键蛋白分子在减数分裂过程中的分布、运动和相互作用规律，探索其在同源染色体精确分离时的时间和空间调控原理，推演染色体非整倍体发生的分子机制。项目成果将为活细胞内多分子实时动态研究提供新方法，对阐明卵母细胞减数分裂过程的多分子协同作用具有重要的学术价值，同时对预防和控制非整倍体畸变、降低新生儿出生缺陷具有重大的社会意义。

卵母细胞发育过程涉及细胞内多种亚细胞结构和相关蛋白在空间和时间上的协同作用，其减数分裂是该过程的一个重要研究窗口，通过成像方法揭示卵母细胞减数分裂过程中多分子共定位情况，对于揭示卵母细胞发育异常的分子机制具有重要意义。.本项目设计并建立了一套三维STORM超分辨荧光显微成像系统，用于获取卵母细胞减数分裂过程中重要蛋白的结构与空间信息；完善并优化了原矾酸钠处理的卵母细胞体外培养异常成熟体系，用于荧光标记物量子点的生物学效应研究以及卵母细胞超分辨成像研究；利用多色荧光显微成像技术和皮尔逊共定位定量分析方法，记录并分析了减数分裂过程中卵母细胞纺锤体上微管蛋白、动力蛋白以及染色体的共定位情况。结果表明，STORM超分辨成像系统在二维平面可分辨直径为142 nm的纺锤体微管束，在三维空间上可以对700 nm纵深空间上的纺锤体结构进行成像，正常卵母细胞的纺锤丝纵深跨度为175 nm以内，而异常发育的卵母细胞纺锤丝纵深跨度约为560 nm，纺锤体结构和走向紊乱；不同浓度原矾酸钠构建的卵母细胞异常发育模型，可以稳定控制卵母细胞的成熟比率，与正常发育的卵母细胞体外成熟率存在显著性差异；正常成熟卵母细胞的纺锤体呈双极型，染色体规则的排列在赤道板上，动力蛋白主要分布在两极上端；原矾酸钠处理异常成熟的卵母细胞，纺锤体形态不规则，染色体排列杂乱无章，动力蛋白分布较均匀，不再集中两极上端；皮尔逊共定位定量分析方法表明，原钒酸钠通过提高卵母细胞减数分裂过程中纺锤体两极区微管蛋白和动力蛋白的共定位，从而影响卵母细胞的正常发育。.以上研究成果，在本领域重要学术期刊发表学术论文16篇，其中SCI收录论文13篇，部分研究成果获广东省科学技术三等奖，相关研究课题培养硕士研究生5名、博士后1名。项目所构建的成像平台为卵母细胞发育过程提供了一种精细、直观、定量化的研究策略，对于揭示活细胞内复杂动态过程具有重要的学术价值。