动态荧光寿命追踪-超分辨关联显微成像技术研究

Intracellular material transport disorder can lead to cell dysfunction, which is closely related to the occurrence and development of many human diseases. Vesicular transport driven by motor proteins is the main form of intracellular transport, and its regulatory mechanism is a major scientific problem in the field of cell biology. Aiming at the characteristics of this kind of problems, this project studies and develops a time-lapse fluorescence lifetime tracking and super-resolution correlative microscopy. Starting with a fast fluorescence lifetime microscopic imaging technique based on acousto-optic deflection scanning and time-correlated single photon counting, which was developed by the group previously, the proposer will introduce a single particle tracking method and feedback control into the system to study and realize the dynamic tracing of fluorescence lifetime of moving objects, which will then be correlated with the single-molecule localization super-resolution fluorescence microscopy. The correlative method will be used firstly to track and measure the fluorescence lifetime of moving vesicles in living cells to monitor the interaction of the moving vesicles along the path of motion, and then to fuse the lifetime trajectories with the super-resolution structural information of the cytoskeleton. Vesicle transport mechanism research will benefit from collecting such direct images and data in nano-scale that revealing the relationship between the interactions during transport and the cytoskeletal structure, such as microtubule-microtubule intersections which are found to cause the pause of transporting lysosomes. The realization of the time-lapse fluorescence lifetime tracking technology for moving particles and its correlation with super-resolution microscopy will provide a new powerful research tool for a series of similar problems in life science.

细胞内物质运输障碍会导致细胞功能紊乱，与许多人类重大疾病的发生发展密切相关，由马达蛋白驱动的囊泡运输是细胞内物质运输的主要形式，其调控机制是细胞生物学领域的重大科学问题，具有重要的研究意义。本项目拟针对该类问题的特点，研究并发展一种动态荧光寿命追踪-超分辨关联显微成像技术。为此，将在课题组发展的基于声光偏转寻址扫描和时间相关单光子计数的快速荧光寿命显微成像技术基础上，引入单粒子追踪和反馈控制，研究动态荧光寿命追踪方法，进而将其与单分子定位超分辨荧光显微术进行关联，首先在活细胞状态下快速追踪并测量细胞内运动囊泡的荧光寿命变化以监测其沿运动路径的相互作用，然后与超分辨细胞骨架结构信息进行融合，在纳米尺度下为揭示细胞内囊泡运输与骨架结构间的关系和运输调控机理的研究提供直接的数据。动态荧光寿命追踪技术的实现及其与超分辨成像技术的关联融合，将为一系列类似的生命科学问题提供一种新的强有力的研究手段。

本项目研究动态荧光寿命追踪-超分辨关联显微成像技术，以期实现在活细胞状态下追踪并测量细胞内运动目标的荧光寿命，实时监测其在运动路径上的相互作用或微环境变化，进而通过超分辨关联将其与细胞内的超分辨结构信息相结合，并初步应用于细胞生物学问题的研究。项目取得的主要研究成果包括：1）搭建了基于声光偏转寻址扫描和时间相关单光子计数（TCSPC）的快速荧光寿命显微成像（FLIM）系统，实现了对生物样品中任意数量离散不规则感兴趣区域的快速FLIM成像，单帧FLIM图像采集时间最快仅需52.2ms；2）解决了实现动态荧光寿命追踪的关键技术问题，研发了适用于低光子数情形的荧光寿命分析算法，实现了对运动粒子的荧光寿命追踪成像，获得了可反映粒子沿运动路径相互作用或微环境变化的实时寿命轨迹；3）实现了动态荧光寿命追踪和单分子定位显微（SMLM）成像在系统上的关联，解决了关联成像系统的轴向漂移问题，系统成像空间分辨率约为30nm，寿命探测的时间分辨率约为120ps；4）发展了SMLM超分辨成像样品标记新方法，发展了三维SMLM成像新方法和多种超分辨图像重构算法，提高了SMLM超分辨成像的空间和时间分辨能力；5）实现了活细胞内运动溶酶体的动态荧光寿命追踪成像，研究了溶酶体在不同运动形式下其管腔内pH值的不同变化规律，实现了细胞间隧道纳米管的单色、双色和三维SMLM超分辨成像，为进一步将项目所发展的技术应用于生物学研究奠定了基础。基于上述研究成果，在国内外学术期刊上发表研究论文25篇，其中SCI收录20篇、EI收录19篇，申请国家发明专利14项、实用新型专利3项，其中已获授权发明专利4项、实用新型专利2项，培养博士后研究人员2名、博士研究生2名、硕士研究生6名，获得市级科学技术奖自然科学类二等奖奖励1项。该动态荧光寿命追踪技术的实现及其与超分辨成像技术的关联，将为细胞内囊泡运输调控机制等细胞生物学领域的重要科学问题研究提供一种新的强有力的手段。