金属β-内酰胺酶以及在细菌活细胞体内活性的实时监测与抑制研究

Metallo-β-lactamase (MβLs) including NDM-1 led to the "super bacteria" resistance, which is the hot spot that people currently pay close attention to. The project intends to do expression and purification of the MβLs from each B subclass of them, inclusding NDM-1, CcrA, ImiS and L1 etc.; construction and development of azolyl thioacetamide derivatives, characterization of their chemical composition and structures, evaluation of their inhibitory activity against MβLs by enzyme kinetics; testing their synergies in combination with antibiotics to inhibit the antibiotic resistant bacteria with MIC method; determination of the thermodynamic parameters of them inhibiting MβLs and conversion of enzyme stability conformation states using isothermy titration microcalorimetry (ITC); recombinant of Co (II) substituted Co-MβLs, spectroscopy characterization of interaction between inhibitors and MβLs and effect of intensity, bonding sites and bonding direction of the inhibitor etc.; preparation of the ordered crystals of inhibitor-MβLs complexes by soaking technology, and obtaining direct evidence by resolution of the interaction mode; using an innovation UV-Vis method of cell non-invasive, real-time monitoring the activity of MβLs in living cells of antibiotic resistant bacteria, and studing on inhibition of the enzymes in situ, further exploration of the structure of MβLs and their interaction with other cellular components in complex biological network environment etc. Run of this project will provide information with important valuable for the development of new antibacterial drugs.

金属β-内酰胺酶（MβLs）包括NDM-1所导致的“超级细菌”耐药是人们目前密切关注的热点。该项目拟表达并纯化所有三个B组群具代表性的MβLs，包括 NDM-1、CcrA、ImiS及L1等；构建和发展唑基硫代乙酰胺衍生物，表征其化学组成与结构，酶动力学测定其对MβLs的抑制活性；MIC评价其协同抗生素对产MβLs耐药菌的抑制效能， ITC测定其抑制MβLs水解抗生素的热力学函数及酶稳定构象态的转化；重组Co-MβLs，光谱表征抑制剂与MβLs的作用及作用强度、抑制剂的键合位点及键合方向等；浸透法制备抑制剂-MβLs复合物之有序晶体，解析结构获得其作用模式的直接证据；创新一种对细胞非侵入性的UV-Vis方法，实时监测耐药菌活细胞体内MβLs的活性，进行原位抑制研究，进而探索在复杂生物网络环境中MβLs的结构以及与其它细胞内成分的互动等。该项目的实施，将为发展新型抗菌药物提供有重要价值的信息。

金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases, MβLs）是细菌产生耐药性之靶蛋白。本项目在E.coli中分别表达并纯化了三个组群中7个抗生素耐药靶蛋白MβLs：NDM-1、CcrA、VIM-2、IMP-1、Bla-2、ImiS、L1、以及万古霉素耐药靶蛋白VanX，SDS-PAGE凝胶电泳确认其纯度在95%以上；发展了一项UV-Vis光谱和一项等温微量热（ITC）技术，实现了对耐药细菌活菌体内MβLs的实时监测与抑制。这两项技术可广泛用于在复杂生物网络环境中对特定生物化学反应的监测；发展两类靶向B1和B2组群MβLs的共价抑制剂分子骨架：依布锡（Ebselen）和依布硫（Ebsulfur），实现了对MβLs在耐药菌活菌体内的摄入、分布及其聚集态演变的示踪与抑制，其对NDM-1的抑制活性（IC50）达11 nM，使得先锋V对产NDM-1临床耐药菌（EC24）的抑菌活力提升一万倍以上；构建、发现对MβLs具有抑制、广谱抑制效能的5类骨架结构的抑制剂：唑基硫代乙酰胺、氨基酸硫酯、氨酰甲基硫醚、罗丹宁、DNA纳米带，合成发展衍生物500多个，其抑酶活性达纳摩尔级。这些抑制剂协同先锋V使得其对产MβLs超级耐药细菌的抑制能力提高达1000倍；发明一类新型抗菌试剂ASC系列，其可协同8种抗生素有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），抑制率达95%；应用UV-Vis、ITC、NMR等技术，在分子和细胞水平上研究了抑制剂与MβLs的作用机制；共结晶法制备两种MβL-抑制剂复合物的共结晶体，进而成功解析了其晶体结构（1.72、1.78 Å），获得抑制剂分子与MβLs键合的直接证据。培养博士生6名，硕士生13名，本科生20名。其中12人获国家/省级大学生创新项目资助，5人获第四届中国“互联网+”大学生创新创业大赛陕西赛区银奖（2018）。在Chemical Communications、ACS Infectious Diseases、Biomaterials Science、Future Med. Chem.等国际主流学术期刊发表SCI论文20篇，其中以通讯作者发表论文20篇。申报专利1项。通过本项目研究所取得的重要成果，为攻克超级细菌耐药之难题提供了新物质和新技术。