鸡盲肠上皮细胞系构建及生物学特性的研究

At present,Eimeria tenella(E.tenella) is one of pathogens threatening poultry industry in our country. Cecum epithelial cells is its host cells of chicken，but there is no available for the E.tenella in vitro study of the host cell line. This project aimed at the primary culture condition and characterization of cecum epithelial cell lines from chicken embryo.By choosing digestive enzyme and planting density,purifying the cultured cells and optimizing cell growth condition, the chltured cells were identified as cecum epithelial cells that had high purity.Cells were cultured in optimal condition,growth curve was drew basing on cell viability by MTT method, and detection of chromosome analysis and isoenzyme for the cell lines. Established chicken caecum epithelial cell lines in E.tenella of host cell damage mechanism, and the study provides a cell model in vitro.

目前，柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是严重危害我国养鸡业的病原体之一。盲肠上皮细胞是其宿主细胞，但还没有可供该球虫体外研究的宿主细胞系。本项目针对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的条件和细胞的系的生物学特性进行研究，通过对鸡胚盲肠上皮细胞分离消化酶筛选、种植密度选择和对培养细胞进行纯化及培养条件的优化，最后鉴定所培养细胞为纯度较高的盲肠上皮细胞，并用所选出的最佳条件培养细胞，用MTT法测定细胞活力，绘制细胞生长曲线，并对该细胞系进行染色体分析和同工酶检测。鸡盲肠上皮细胞系的建立对E.tenella为宿主细胞的损伤机制及抗球虫药的研究提供体外细胞模型。

本项目旨在建立和鉴定一种来源于鸡胚盲肠组织的新型上皮细胞系--鸡胚盲肠上皮细胞系，为研究柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）分子及其发病机制提供理想的细胞模型。结果显示，原代培养细胞来源于14日龄或15日龄SPF鸡胚盲肠组织，利用50μg/mL嗜热菌蛋白酶对鸡胚盲肠组织进行消化110min分离鸡胚盲肠上皮细胞，用DMEM/F12培养基添加2.5%胎牛血清、20ng/mL EGF、10μg/mL胰岛素、1.5μg/mL氢化可的松、1mg/mL肝素钠、5μg/mL转铁蛋白、1μg/mL纤连蛋白作为鸡胚盲肠上皮细胞培养基，41℃，8% C02条件下培养，对鸡胚盲肠上皮细胞进行纯化培养。纯化后的鸡胚盲肠上皮能有效生长15代。体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞具有典型的“铺路石样”肠上皮细胞形态。透射电镜观察，鸡胚盲肠上皮细胞呈椭圆形或小圆形，细胞核呈椭圆形，且大而不规则，可见一个大而突出的核仁。透射电镜进一步分析表明，鸡胚盲肠上皮细胞表面微绒毛密度较高，细胞质中含有大量的分泌小泡、脂滴和内质网。采用RT-PCR和免疫荧光法检测角蛋白-18和E-钙粘基因和蛋白的表达，鉴定纯化的鸡胚盲肠上皮细胞为上皮细胞。本项目的研究结果表明，鸡胚盲肠上皮细胞系可以在培养基中良好的生长，并具有的特性（1）很强的粘附能力；（2）很强的增殖能力；（3）“铺路石样”的上皮形态；（4）细胞的群体倍增时间为20.62h。鸡胚盲肠上皮细胞传代至第15代染色体核型保持不变，且无支原体污染。进一步鉴定表明，该细胞系在传代后仍能正常生长。最后，对建立的鸡胚盲肠上皮细胞系进行E.tenella侵染评价。本项目的结果表明，E.tenella能够在新的细胞系中复制。因此，本研究所建立的鸡胚盲肠上皮细胞系是一个适合于E.tenella感染和损伤研究的体外模型。