鸡志贺菌IpaC蛋白的肠上皮细胞受体鉴定及特性分析

Item abstract：Shigella can cause dysentery to people and cattle,IpaC protein from shigellae is very important antigen which mediates invasion of epithelium. The search shows that shigellae from chicken and people have the same IpaC protein,but it has never had reported about IpaC receptor in the surface of chicken epithelium,so it's hard to search the pathopoiesis of shigellae from chicken.This rearch decides to clone IpaC gene,express IpaC protein,identify receptor of IpaC protein and its candidate gene with some techniques,such as monoclonal antibody technique, T7 bacteriophage Library sieve, western blotting.Structural feature and biology feature of receptor of IpaC protein in the surface of chicken and people epithelium and it's gene are searched through comparison,and then reveal the adsorption mode and invasion mode, tissue tropism, pathogenesis, meanwhile potential possibility of infection and propagation is evaluated.

申请项目摘要：志贺菌可引起人、畜菌痢，IpaC 蛋白是介导志贺菌侵入肠道上皮的主要抗原分子。研究表明鸡源志贺菌拥有与人源菌株相同的IpaC 蛋白分子，但因未见鸡肠上皮细胞表面IpaC 受体的相关报道，使鸡源志贺菌致病机理的研究遇到困难。本研究拟通过克隆、表达鸡源志贺菌IpaC蛋白基因获得该蛋白，以单抗技术、T7噬菌体文库筛选、铺覆蛋白印迹技术等，应用于鸡源志贺菌IpaC蛋白受体及其候选基因的鉴定。对鸡和人肠上皮细胞表面的IpaC蛋白受体及其基因的结构特征和生物学特征进行比较研究，揭示鸡源志贺菌的吸附侵入模式、组织嗜性、致病机理，并评估鸡源志贺菌在人群中感染和传播的潜在可能性。

肠上皮细胞的IpaC蛋白受体是志贺菌毒力因子IpaC蛋白的互作配体，本课题通过利用免疫沉淀和GST pull-down两种不同的技术方法寻找鸡肠上皮细胞上的鸡源志贺菌IpaC蛋白受体，结合运用分子生物学、免疫学和细胞生物学等方法与技术，对该受体参与IpaC蛋白分子的致病机制进行了研究。首先基因克隆测序，测得IpaC基因片段全长为1092bp，构建载体原核表达，测得IpaC蛋白分子量为63 kDa；原核表达获得了稳定表达的IpaC蛋白，结果表明上清和包涵体中均存在较多目的蛋白，上清中该蛋白经纯化纯度可达90%以上。构建载体酵母表达，经优化变构IpaC基因多次试验，结果均表明酵母以胞内表达为主，上清表达量很少。以纯化的IpaC蛋白为抗原制备其单克隆抗体，选用鸡胚肠上皮细胞进行原代培养，以铺覆蛋白印迹技术测定受体的分子量约55 Kda，以免疫沉淀法和GST pull-down技术进行鸡源志贺菌IpaC蛋白鸡肠上皮细胞受体的筛选与鉴定。后经质谱检测和生物信息学分析，挑选出8个感兴趣的成员，分别为：膜联蛋白A2、37KDa层粘连蛋白受体、LIM和SH3蛋白1、Ras相关蛋白Rab-43、细胞黏附分子、Rab23 GTP酶、肌动蛋白相关蛋白2、PDZ和LIM结构域蛋白7。关于这8个受体候选分子的氨基酸序列均可在NCBI蛋白数据库中查出。通过筛选和鉴定，结果显示这8个候选分子均可以和IpaC蛋白结合，故推测这些候选分子为IpaC蛋白的受体。关于受体分子的细菌结合易感细胞阻断实验和非易感细胞试验的工作正在进行。综合上述结果，本研究为探讨鸡源志贺氏菌侵入鸡肠上皮细胞的致病机理奠定了坚实的工作基础。同时对于认识鸡源志贺氏菌的吸附侵入模式、组织嗜性、致病机理以及评估该菌在人群中感染和传播的潜在可能性提供了重要的科学依据。项目资助发表重要核心论文7篇，待发表2篇。培养硕士生6名，均已毕业取得硕士学位。项目投入经费82万元，支出65.9246万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费16.0754万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。