家蚕微孢子虫中与极管相互作用的孢壁靶蛋白的鉴定研究

家蚕微孢子虫专性寄生于经济昆虫家蚕，其经卵垂直传播所引发家蚕微粒子病给我国和世界蚕业经济造成巨大危害。研究表明，微孢子虫通过弹出极管、刺入并将孢内物注射进宿主细胞内，完成入侵过程,极管在侵染中发挥着至关重要作用。通常极管在常态直至激活弹出前呈螺旋盘升状贴壁固定于细胞内壁，但其贴壁的分子机理尚未见任何报道。本研究小组在参与家蚕微孢子虫全基因组测序的部分工作基础上，鉴定了组成极管的蛋白基因序列。此外，在对孢壁蛋白的前期研究中已发现1个孢壁蛋白与极管存在相互作用的关系。本项目基于已有家蚕微孢子虫全基因组数据平台，以已开展的极管和孢壁蛋白的研究为基础，运用酵母双杂交和蛋白质组学等技术，实验鉴定家蚕微孢子虫极管蛋白的组成，寻找并鉴定参与极管贴壁功能的极管蛋白和对应相互作用的孢壁靶蛋白，对孢壁靶蛋白的时空表达和功能进行系统深入的研究，为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制以及家蚕微粒子病的防治奠定坚实的基础。

家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，对我国乃至世界养蚕业危害极大。极管是微孢子虫入侵宿主的最关键细胞器。微孢子虫被激活后，其极管瞬间弹出、刺入并将孢内物注射进宿主细胞内，完成入侵过程。而微孢子虫在被激活前，其极管则始终呈螺旋盘升状贴壁固定于细胞内壁，但贴壁的分子机理尚未见任何报道。本项目以极管蛋白与孢壁蛋白的相互作用为着眼点，围绕极管如何贴壁固定于细胞内壁这一科学问题，进行了全面研究。项目执行至今，各项指标均已完成。现将重要成果摘要如下：1）完成了家蚕微孢子虫天然极管蛋白的提取和质谱鉴定工作，鉴定发现极管主要由蛋白PTP1、PTP2、PTP3和少量假定极管蛋白组成；PTP1和PTP2自孢子发育早期直至成熟都有表达；间接免疫荧光和免疫胶体金定位分析结果表明，PTP1、PTP2的抗体都能与弹出的极管产生免疫印迹效应。成熟孢子冰冻切片的免疫胶体金定位也显示，极管蛋白PTP1和PTP2明显表达定位在极管上。2）成功构建了酵母双杂交系统所需的家蚕微孢子虫cDNA文库。通过运用酵母双杂交、免疫共沉淀、Far western技术，艰难寻找并发现了能与极管蛋白PTP1相互作用的孢壁靶蛋白SWP5、SWP25、SWP30和SWP32。暗示这4个孢壁蛋白可能参与了极管的贴壁过程。3）对与极管互作的孢壁蛋白SWP5、SWP25、SWP30和SWP32，在家蚕微孢子虫孢子入侵家蚕后第1-8天的转录情况调查发现，SWP25自孢子感染宿主第一天起开始转录，SWP5和SWP32自孢子感染宿主的第三天起开始转录，SWP30自孢子感染宿主的第四天起开始转录，直至新一代孢子在宿主体内增殖生活史的完成；通过克隆表达并制备这4个孢壁蛋白的抗体，借助抗体利用间接免疫荧光和免疫胶体金定位方法，获得了这4个与极管互作蛋白在家蚕微孢子虫成熟孢子的亚细胞定位信息。其中，SWP32表达定位在孢外壁，SWP30和SWP25表达定位在孢内壁，SWP5表达定位即在孢外壁也在孢内极管区域。不同孢壁蛋白转录表达时间的不同、精细定位也不尽相同，暗示了它们在孢子发育成熟过程中扮演不同角色、发挥不同功能。4）发现了孢壁蛋白SWP5能影响极管的贴壁固定作用。经SWP5 抗体处理的孢子其极管弹出率较对照组下降30～42%。经SWP5 抗体孵育的孢子感染幼蚕后，幼蚕存活率显著高于对照组，说明SWP5在孢子对宿主的侵染中起着重要作用。