泛素连接酶E3 N-端识别子调控Cav1.2通道蛋白功能性表达的机制研究

The alpha 1C subunit of L-type voltage-dependent calcium channel (Cav1.2) is essential for action potential formation and electrophysiological homeostasis in the heart. The ubiquitin proteasome system (UPS) is a major degradative system for intracellular proteins including ion channels. The ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin (UBR) family is a part of the UPS; however, their roles in regulating cardiac Cav1.2 channels remain elusive. Here, we found that all of the UBR members were expressed in cardiomyocytes. Individual knockdown of UBR3 or UBR6, but not of other UBR members, significantly elevated the amplitude of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release (CICR) without affecting Ca2+ re-uptake in rat cardiomyocytes. Western blotting measurements of the Ca2+-handling proteins involved in Ca2+ influx-induced Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum CICR showed that Cav1.2 proteins were increased in UBR3/6 knockdown cardiomyocytes, whereas the protein levels of other related proteins remained unchanged, suggesting a degradative modulation of UBR3/6 on Cav1.2. This study aimed to explore the effect of UBR family on the electrical activity of the ion channel proteins of myocardial cell membrane and the related molecular mechanism, so as to provide novel ideas and new therapeutic targets for clinical diagnosis and treatment of the related diseases of abnormal Cav1.2 channel.

心肌细胞L型电压门控钙通道Cav1.2在心脏动作电位形成和电生理稳态的维持中发挥重要作用。尽管泛素蛋白酶体系统（UPS）调节离子通道蛋白在内的多种膜蛋白的降解过程，但是泛素蛋白连接酶E3 N-端识别子（UBR）作为UPS的重要组成部分,其在心肌细胞Cav1.2通道蛋白质控中的作用尚不清楚。我们研究发现，心肌细胞中表达UBR所有亚型（UBR1-7）。选择性失活UBR3和UBR6导致大鼠心肌细胞Cav1.2通道蛋白水平及Ca2+瞬变幅度明显增高，提示，UBR3和UBR6负向调节Cav1.2通道蛋白的功能性表达。本研究旨在探索UBR调控心肌细胞Cav1.2通道蛋白及相关电生理的分子机制，为理解心脏离子通道稳态的调节提供新的研究视角，并为心脏Cav1.2通道异常相关疾病的防治提供新思路与药物干预靶点。

泛素蛋白酶体系统（UPS）可调节离子通道蛋白在内的多种膜蛋白的降解过程，但是泛素蛋白连接酶E3 N-端识别子（UBR）作为UPS的重要组成部分,其在心肌细胞L型电压门控钙通道Cav1.2通道蛋白质控中的作用尚不清楚。本课题聚焦于UBR，旨在研究其在心肌细胞膜Cav1.2通道及相关心脏电生理的质控及其作用机制。本研究发现，逐一敲除UBR家族的七个成员后检测心肌细胞内Ca2+瞬变的幅度和Ca2+的再摄取，惟UBR3和UBR6使钙瞬变的幅度明显升高。对钙瞬变相关膜蛋白进行筛查，发现敲减UBR3/6后仅Cav1.2通道蛋白的水平有所增高，而其他蛋白包括RyR2, SERCA2a和PLB则无显著变化。提示UBR3/6通过Cav1.2 通道蛋白调控心肌细胞Ca2+瞬变。后利用膜片钳技术，在新生鼠心肌细胞中检测UBR3/6敲减后Cav1.2通道的电流变化。发现UBR3和UBR6的下调均可增强Cav1.2通道的开放，即UBR3和UBR6对Cav1.2通道的功能亦有影响。在蛋白合成抑制剂作用下UBR3/6敲减引起的Cav1.2通道增加无显著改变，提示UBR3/6可能通过降解Cav1.2通道的表达而影响心肌细胞钙瞬变。由此我们可以推断UBR3/6可能通过影响Cav1.2通道的降解发挥调节作用。此外，在此研究过程中还发现UBR家族中UBR1对心肌肥厚具有潜在的调控作用，追寻线索及时追踪后证实了UBR1通过cFOS调控途径调控心肌肥厚。本研究证实了UBR调控心肌细胞Cav1.2通道蛋白及相关电生理的分子机制，为理解心脏离子通道稳态的调节提供新的研究视角，同时发现了UBR1对心肌肥厚的调控。以上研究为Cav1.2通道相关心血管疾病以及心肌肥厚的发生机制提供新的认识，有助于为相关心脏疾病的诊治提供新的理论依据、分子标记与治疗靶标。.该课题基本完成预期研究。部分项目成果发表SCI文章1篇。此外，该项目资助发表3篇SCI文章。协助培养博士研究生1名。