免疫网状滚环扩增技术用于高转移性乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定与检测研究

Breast cancer metastasis is caused by the circulating tumor cells (CTCs) in blood. But on the other side, CTCs are also an ideal target for the monitoring and prognosis of metastasis. Now it is generally recognized that to identify and analyze the molecular phenotype of CTCs on the basis of the CTCs counting is a developing trend. Latest research reveals that some CTCs which overexpress junction plakoglobin (JUP) on their cell membrane have 23- to 50-fold increased metastatic potential. To identify and detect those highly-metastatic CTCs with overexpressed JUP will do favor to the early screening and monitoring of breast cancer metastasis. In this project, by integrating the advantages of immunoassay technique and nucleic acids amplification technique, we are going to study and develop a novel detection technique named as “immuno-netlike rolling cycle amplification” (Im-NRCA). By using this technique, we aim to detect the expression level of JUP on CTCs, and thus to identify and detect those CTCs with high metastatic potential. The launching of this project will fill the gap for the early monitoring of breast cancer metastasis by targeting JUP, and also provide a new method for the identification and analysis of the molecular phenotype of CTCs.

血液中极少量的循环肿瘤细胞（CTCs）是导致乳腺癌转移的罪魁祸首，但也是辅助乳腺癌转移监控及预后判断最重要的靶标。目前普遍认为，在现有CTCs计数检测的基础上，对CTCs分子表型进行鉴定分析从而评估其转移潜能是今后的发展趋势。最新的研究结果表明，乳腺癌CTCs中有一类可过表达斑珠蛋白（JUP），其转移潜能是JUP低表达CTCs的23-50倍。对过表达JUP的高转移性CTCs进行鉴定检测有望更好地服务乳腺癌转移的早期筛查和监控。本项目拟结合免疫检测及核酸扩增两类技术的优势，研究和发展一种称为“免疫网状滚环扩增”的新型检测技术，在不破坏细胞结构的前提下，对CTCs的JUP表达水平进行灵敏的定量分析，进而实现对过表达JUP的高转移性CTCs的鉴定和检测。该项目的开展一方面将弥补目前针对JUP这一重要标志物进行乳腺癌转移早期监控研究的空白，另一方面也将为CTCs分子表型的鉴定检测提供新的技术支持。

本项目提出通过研究和发展“免疫网状滚环扩增”技术，实现对循环肿瘤细胞关键膜蛋白的无损定量分析，并以此为基础实现高转移性乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定与检测。在项目实施过程中，我们紧密围绕项目的建设目标，并按照预定实施方案开展了一系列相关的研究工作：（1）深入研究了“免疫网状滚环扩增”技术，筛选出了Klenow DNA聚合酶和Nb.BbvCI切刻内切酶的组合，使之可在生理温度下和细胞培养基这一相对复杂体系中运行。（2）成功将“免疫网状滚环扩增”技术用于多个癌细胞系的斑珠蛋白表达水平的定性和高灵敏定量分析。（3）研究了分析体系的温和性和对细胞的无损性，通过对细胞状态、增殖、药敏等多个维度的监测，实现了细胞的无损分析。（4）设计和制备了微流控芯片使之可以捕获并用于CTC单细胞的分析。除此以外，我们在“免疫网状滚环扩增”技术的拓展性应用以及癌细胞膜蛋白的相互作用分析等方面也取得了可喜的成果。这些工作的开展一方面为基于CTC分析的高转移性乳腺癌的诊断和预后提供了潜在的支持，另一方面也为基于免疫识别和核酸扩增的生命分析提供了重要的工具。在项目研究过程中，已正式发表标注有国家自然科学基金（21575088）的SCI论文24篇（其中第一作者或通讯作者22篇，影响因子大于10的2篇），申请专利6项，超额完成项目的既定目标（发表SCI论文8-12 篇，申请专利3-4项）。