高分辨力谱研究膜蛋白的错误折叠

Membrane proteins perform versatile cellular functions and their misfolding has been linked to multiple diseases. Notwithstanding the ubiquitous nature and substantial clinical relevance of these proteins, our understanding of the mechanism of membrane protein misfolding lags well behind soluble proteins. Atomic force microscopy has been developed into an important technique that enables high-precision studies of membrane proteins in their native lipid bilayer. Despite the success, traditional force spectroscopy studies lack the spatio-temporal precision to resolve many details during protein folding, especially those within the complex misfolding network of membrane proteins..This project takes advantage of 1-microsecond resolution single-molecule force spectroscopy we recently developed to study the folding and misfolding of diacylglycerol kinase, a model membrane protein with a library of mutants prone to misfolding. With a world-leading combination of force precision, stability, and time resolution, the energetics and the kinetics of structural transitions, locations of important intra- and inter-helix interactions, folding transition path, and the underlying folding energy landscape of diacylglycerol kinase will be measured in detail. The topology assembly of native and mutant proteins under different environments will be determined. An unprecedented level of molecular details within the complex misfolding pathways of different mutants will be elucidated, to provide mechanistic insight into the formation of non-native structures of membrane proteins. This project will establish high-resolution force spectroscopy as a general platform to study membrane protein folding at the single-molecule level, with wide applicability for understanding disease and biological function.

膜蛋白参与丰富的细胞功能，其错误折叠与许多疾病息息相关。而我们对于膜蛋白错误折叠机制的理解远落后于可溶性蛋白。原子力显微镜已经发展成为膜蛋白在自然双分子脂膜中高精度研究的重要方法。但是，传统力谱缺乏足够的分辨率来解析折叠过程，尤其是膜蛋白的复杂错误折叠网络中的各种细节。.本项目将我们之前发展的1微秒分辨率单分子力谱应用于一种模型膜蛋白——甘油二酯激酶——的折叠和错误折叠研究。该跨膜蛋白的诸多突变体均有很大错误折叠倾向。本项目将利用我们发展的高分辨率单分子力谱详细测量甘油二酯激酶的结构转变能量，动力学，重要相互作用位置，折叠过渡路径，以及折叠能量图谱。同时我们还将研究不同环境下甘油二酯激酶的拓扑组装结构。进一步，项目将揭示不同突变体错误折叠路径的细节，以理解膜蛋白非自然结构的形成机理。项目将建立以高分辨力谱为手段的膜蛋白折叠单分子研究的通用测量平台，以用于疾病及分子功能等方面更广泛的研究。

膜蛋白具有重要生物功能，但目前人们对膜蛋白的折叠机制及错误折叠的发生机制的认识仍然不足。膜蛋白的疏水性及其所处的脂质双层膜环境给上述问题的研究造成了较大困难。项目利用原子力显微镜，在单分子层面，对近天然人工磷脂膜或天然质膜中的膜蛋白的折叠过程进行研究，为折叠机制的解析提供了独特的视角。.项目首先通过聚焦离子束优化探针和外建光路两个途径，发展了更高时间空间分辨的原子力显微镜力谱测量方法。同时，项目发展了基于多种力谱实验方法（平衡态和非平衡态实验）和基于多种理论基础（动力学理论、Crooks涨落理论和Boltzmann理论）的膜蛋白结构转变自由能、动力学及能量图谱的精确测量方法，论证了每种分析方法的可靠性。在此基础上，项目以大肠杆菌的一种跨膜蛋白甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase，DAGK)为主要模型，发展更高效的特异性力谱测量方法，实现了对该蛋白力学去折叠过程的高分辨测量，解析了DAGK的完整去折叠路径。为解析决定膜蛋白内部结构稳定性的重要相互作用，项目提出了结合单分子实验和多种计算模拟的整合方案，可以绕过传统方法中间态结构定位不准的问题，使得膜蛋白的去折叠中间态的定位达到接近单个残基的水平。基于全原子分子动力学模拟的增强采样计算折叠自由能面，能够重现实验观测的去折叠中间态，并能够确定决定各中间态的关键相互作用。基于相互作用分析的突变实验发现了决定DAGK三聚体稳定性的关键相互作用。相应突变体的力学稳定性和热稳定性发生了下降，验证了这些相互作用的破坏是突变体折叠异常的主要原因。.项目建立的高分辨、高效的力谱测量方法和实验模拟整合分析方法能够为其他更多种类的膜蛋白的折叠机制研究提供通用的研究手段，以用于疾病相关的膜蛋白异常折叠及功能机制等更广泛的研究。