Q型烟粉虱RNAi过程中dsRNA吸收途径研究

At least two pathways for dsRNA uptake in insects are described by latest research: the transmembrane channel-mediated uptake mechanism based on sid-1 protein and an 'alternative' endocytosis-mediated uptake mechanism. Based on pre-experimental results of Bemisia tabaci RNAi and genome blast research, we have identified the core RNAi genes, as well as genes potentially involved in transmembrane channel-mediated uptake mechanism and the endocytosis-mediated uptake mechanism. First, feed gene-specific dsRNA on emergence of B. tabaci female adults to post-transcriptional silencing other organizations of the female ovary expression vitellogenin receptor gene, this phenomenon would promote identification of systemic RNA interference of B. tabaci. Second, sid1 gene associated with the transmembrane channel-mediated uptake pathway would be identified which involved in dsRNA uptake using an 'RNAi of RNAi' approach in B. tabaci adults. The role of endocytosis in environmental RNAi was checked by blocking the endocytosis with pharmaceuticals against endosome maturation (bafilomycin A1 against vacuolar H+ ATPase) in B. tabaci cell line. Understanding different uptake pathways and systemic RNAi would highlighting the achievement of implementing RNAi in B. tabaci control with transgenic plants, and would assist with selection of positive approaches of gene functions investigation using RNAi technology in B. tabaci. This project would influence further research on dsRNA uptake mechanisms and the promising application possibilities for RNAi in insect control.

最新研究发现昆虫细胞对dsRNA的吸收主要有两种不同的路径：跨膜通道吸收和内吞作用。本研究基于前期烟粉虱RNAi的实验结果，以及对烟粉虱RNAi核心机制和传递路径的关键基因比对结果，首先采用烟粉虱羽化后成虫饲喂dsRNA，透过中肠等组织去沉默目标基因- - 雌虫卵巢特异表达的卵黄原蛋白受体基因的方法，来验证烟粉虱的RNAi系统性现象。然后采用抑制系统RNAi途径中关键跨膜通道基因sid1或者抑制环境RNAi内吞作用关键蛋白Vacuolar H+ ATPase的表达，检测路径关键基因沉默条件下烟粉虱RNAi效果变化的方法，验证烟粉虱的dsRNA吸收路径问题。烟粉虱是否具有系统性RNAi及其吸收路径，将决定通过植物表达dsRNA来控制烟粉虱的效果，也决定烟粉虱RNAi基因功能研究应采取的技术手段。本研究将丰富RNAi机制理论，并指导烟粉虱RNAi基因功能研究和控制研究。

1. 烟粉虱基因组测序已经完成并即将公布，烟粉虱RNAi吸收机制研究和其遗传操作技术体系，为进一步研究烟粉虱功能基因组学打开了大门，同时可以应用于烟粉虱胚胎期以及胚胎后期发育生理等相关研究。更为广泛的应用，可以推广到相似有卵柄连接叶片的昆虫（如蚜虫）甚至卵产于植物组织内的昆虫（如盲蝽、叶蝉、飞虱等）的遗传操作应用和害虫防治新技术开发上。. 2. 结果表明饲喂双链 sid-1基因、Vacuolar, H+ ATPase基因、VgR基因，具有明显的沉默效果。sid-1跨膜通道蛋白介导的dsRNA吸收路径结果显示，sid-1基因被沉默后，dsRNA吸收通道受到影响，双链VgR基因没有达到沉默效果，由此可以推测sid-1基因就是跨膜通道蛋白的关键基因，沉默sid-1基因后影响了跨膜通道蛋白上dsRNA的吸收。. 3.本研究进一步采用CRISPR/cas9基因组编辑技术阻断sid1基因，探讨dsRNA在烟粉虱中的吸收途径。基于烟粉虱基因组和转录组中搜寻眼色素代谢途径相关基因，克隆验证，并采用CRISPR/cas9技术，成功实现white基因和蝶呤合成途径的vermilion基因的剪切，其遗传转化效率明显高于piggyBac转座子技术。这部分扩展研究成功于该技术开发，针对sid1基因的工作持续进行中。. 4. 本研究探讨烟粉虱胚胎显微注射与注射后发育条件，胚胎期的离叶培养条件，建立较为完整可行的2套适合烟粉虱卵期胚胎显微注射的遗传操作技术体系：人工移卵+双面胶显微操作法；超声波高压洗卵+Matrigel凝固 显微操作法。两种方法显微注射后，烟粉虱卵的发育孵化率相当，Matrigel方法可以实现大规模烟粉虱胚胎显微操作。 应用该技术体系，采用piggyBac转座子转基因技术，实现IE1、pub、3xp3三种启动子分别在烟粉虱成虫表达EGFP、DesRed和CFP三种荧光蛋白。该技术可以在烟粉虱功能基因组研究和害虫控制研究中进一步利用。