赤霉病菌2C型磷酸酶生物学功能的研究及其抑制剂的发掘

赤霉病严重影响小麦的安全生产，同时，病菌产生的真菌毒素严重威胁农产品质量安全。申请人前期研究发现，赤霉病菌双组分信号途径不仅控制病菌致病性和抗逆性，而且还控制病菌毒素的合成。在此基础上，本项目分离鉴定赤霉病菌双组分信号途径的负调控元件2C型蛋白磷酸酶（简称PP2C），研究PP2C的生物学功能并解析其活性结构域；通过体外活性试验筛选PP2C抑制剂，测定不同抑制剂对不同PP2C的专化性，进而在植物活体上测定这些抑制剂对赤霉病防治效果和毒素合成的抑制作用，以明确双组分信号途径上PP2C作为药靶的开发潜力，研究结果为新杀菌剂创制奠定坚实基础。

本项目分离鉴定赤霉病菌双组分信号途径的负调控元件2C型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（简称PP2C）的生物学功能，通过比较基因组学分析发现，小麦赤霉病菌中存在7个PP2C蛋白。基因敲除和互补试验发现，FgPTC3基因在赤霉病菌的菌丝生长、孢子、致病、毒素合成、脂质代谢中发挥重要作用，该基因参与调控多个代谢途径。酵母互补试验表明，FgPTC3基因能够恢复酵母Ptc1突变体多个表型缺陷，表明FgPtc3是高渗透甘油（HOG）信号途径的负调控元件。表型测定发现，其它6个PP2C基因在病菌菌丝生长和致病中作用不明显。为进一步解析FgPtc3蛋白的结构域，通过原核表达获得FgPtc3纯化蛋白，酶活测定发现FgPtc3具有磷酸酶活性。信息生物学分析表明，该磷酸酶上存在8个活性位点，对活性位点的氨基酸进行点突变后发现，突变后的FgPtc3均不能回复酵母Ptc1缺失突变体的表型，表明这些位点对FgPtc3功能有重要的作用。体外酶活测定发现，NaF和 Na3VO4能显著抑制FgPtc3磷酸酶的活性，这两种化合物也显著抑制赤霉病菌生长。在解析赤霉病菌2C型磷酸酶生物学功能基础上，我们系统分析了赤霉病菌中82个磷酸酶基因生物学功能，明确它们在病菌生长、发育、致病和次生代谢中的作用，为筛选适合的磷酸酶作为药靶研发新药剂提供科学依据。