绿僵菌钙调磷酸酶的功能分析及其调控机制研究

钙-钙调磷酸酶是真核生物中一条保守的信号途径，而钙调磷酸酶被认为是真菌抗胁迫的中心调控者，在病原真菌致病过程中也起着重要作用。抗胁迫能力及致病力是杀虫生物农药最为重要的两个性状。绿僵菌作为一种重要的生防微生物，目前尚无钙调磷酸酶功能的相关研究报道。对绿僵菌基因组序列进行比对分析，发现绿僵菌中含有钙调磷酸酶及其调控途径上的一些组分。在此基础上，本项目利用基因敲除及超表达技术，研究钙调磷酸酶在上调及下调后绿僵菌菌株的抗胁迫及毒力变化，阐明钙调磷酸酶在绿僵菌抗胁迫及致病过程中的作用。通过分别比较绿僵菌野生型及钙调磷酸酶突变株在胁迫环境及侵染致病过程中数字基因表达谱差异，发掘大量与抗胁迫及致病直接相关的重要功能基因，阐明钙调磷酸酶对昆虫病原真菌致病及抗胁迫的调控机制。本项目的实施为进一步构建具有高效杀虫活性的真菌生物农药奠定理论基础。

钙—钙调磷酸酶是真核生物中一条保守的信号途径，而钙调磷酸酶被认为是真菌抗胁迫的中心调控者，在病原真菌致病过程中也起着重要作用,但昆虫病原真菌中尚未有报道.通过基因敲除技术敲除钙调磷酸酶催化亚基CnA,研究了钙调磷酸酶在昆虫病原真菌绿僵菌中的作用。结果表明，ΔMaCnA菌落皱缩，菌丝变短，尖端钝化。产孢量下降，产孢结构的形成受到影响。突变体孢子细胞壁变薄，胞壁的β-1,3-葡聚糖和几丁质含量降低，对细胞壁破坏剂和外源钙离子的耐受性增强，对紫外，热，杀真菌剂的耐受性降低。生物测定显示，ΔMaCnA毒力降低。数字基因表达谱显示影响细胞壁，产孢，钙离子转运等基因下调，并影响了其他信号通路中基因的表达。对钙调磷酸酶下游基因Crz1基因功能研究发现，Crz1敲除后某些表型与ΔMaCnA相似，如细胞壁成分下降，对逆境耐受力下降，相应有一些共有的差异表达基因。但也有不同的性状，如ΔMaCrz1细胞壁表面为光滑，而ΔMaCnA表面和WT类似，是有凹凸的粗糙表面。ΔMaCrz1在注射接种情况下，毒力无显著差异，而ΔMaCnA在点滴和注射条件下，毒力都显著降低。这些结果表明，MaCrz1受MaCnA调控的同时，也受到其他途径的调控，导致其功能并未和MaCnA吻合。对钙调磷酸酶相关代谢途径Pls1基因的功能研究发现，Pls1影响真菌的附着胞形成和穿透过程，因此影响了真菌毒力。本项研究阐明了钙调磷酸酶的功能，并对其下游和相关途径的代表性基因进行了研究，阐明了钙调磷酸酶调控病原菌生长，抗逆和毒力的机制，为进一步构建具有高效杀虫活性的真菌生物农药奠定理论基础。