阿司匹林通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路抑制结直肠癌干细胞自我更新的分子机制研究

Self-renewal of colorectal cancer stem cells (CCSC) is the key factor to proliferation, which can result in metastasis, recurrence and therapeutic resistance of colorectal cancer. Aspirin can effectively prevent colorectal cancer development and reduce tumor metastasis. Our study found aspirin inhibited CCSC self-renewal and reduced the expression of β-catenin Wnt/β-catenin pathway target genes (c-myc、cyclin D1). So, We suppose aspirin inhibit CCSC self-renewal through Wnt/β-catenin pathway.We will use Wnt3a interference and β-catenin over-expression to further demonstrate the role of Wnt/β-catenin pathway in inhibition of CCSC self-renewal by aspirin. By means of inhibitor or activator of pivotal molecules in Wnt/β-catenin pathway, we will screen important Wnt/β-catenin pathway molecules which involve in CCSC self-renewal at the level of cell membrane, cell plasma and cell nucleus respectively. By use of biotin-labeled aspirin and immunoprecipitaion, we can further elucidate mode of action between aspirin and β-catenin. This will help to clarify the molecular mechanism of aspirin in inhibiting self-renewal of CCSC, and to provide new viewpoint and research field for revealing pathogenic mechanism and choosing treatment targets of colorectal cancer.

结直肠癌干细胞（CCSC）的自我更新是维持肿瘤持续增殖，最终导致肿瘤转移、复发及治疗抵抗的关键因素。阿司匹林可有效预防结直肠癌发生，降低肿瘤转移。我们研究发现阿司匹林可以抑制CCSC自我更新，降低β-catenin和Wnt/β-catenin通路靶基因c-myc、cyclin D1表达。基于此，我们提出阿司匹林通过调控经典Wnt通路而抑制CCSC自我更新的假说，将通过Wnt3a处理以及β-catenin过表达验证经典Wnt通路是否参与阿司匹林抑制CCSC自我更新的作用；分别从细胞膜、胞浆和胞核作用水平，采用经典Wnt通路关键节点分子抑制剂或激活剂，筛选和鉴定影响阿司匹林这一抑制作用的经典Wnt通路关键分子；通过生物素标记以及免疫共沉淀揭示阿司匹林与β-catenin作用方式。这将阐明阿司匹林抑制CCSC自我更新的分子机制,为进一步揭示结直肠癌的发病机制和筛选治疗靶点开辟新的视点和研究领域。

结直肠癌干细胞的自我更新是维持肿瘤持续增殖，最终导致肿瘤转移、复发及治疗抵抗的关键因素。阿司匹林可有效预防结直肠癌发生，降低肿瘤转移。我们研究显示阿司匹林抑制结直肠癌干细胞的自我更新作用，并且在一定的条件下可以降低β-catenin和Wnt/β-catenin通路靶基因cyclin D1，c-myc的表达。我们通过体外连续传代克隆球形成能力和体内连续传代致瘤能力检测 CCSC 自我更新能力。我们将分选所得的 HT29 细胞和原代结肠癌细胞在 RPMI 1640无血清培养液中培养，呈悬浮生长，随着培养时间的延长，细胞逐渐形成克隆球，体积逐渐增大，数量逐渐增多。然后分别以 0mM, 2.5mM, 5mM 以及10mM 阿司匹林干预连续传代的 HT29 和原代结肠癌肿瘤干细胞，显示阿司匹林作用后 CCSC 克隆球数量显著减少，克隆球体积显著减小，CCSC存活率下降。同时我们采用5mM 阿司匹林作用于 CCSC，结果证实 CCSC 干性基因的表达显著低于对照组贴壁细胞。NOD/SCID小鼠体内致瘤实验证实腹腔内注射5mM 阿司匹林组瘤体显著小于未注射阿司匹林组。这些结果表明阿司匹林抑制了 CCSC 自我更新，而且阿司匹林的这一作用具有CSC特异性。我们进一步采用 TOP/FOP flash 平台、Western Blotting 和免疫组化方法检测 Wnt/β-catenin通路活性及关键分子的表达，结果显示阿司匹林降低了 CCSC Wnt 通路活性。将CCSC皮下接种 NOD/SCID 小鼠，继以 5mM 阿司匹林注入小鼠腹腔内，结果所致肿瘤组织中 β-catenin 表达显著低于未注入阿司匹林组，Wnt/β-catenin 通路靶基因 c-myc 和 cyclin D1表达亦显著低于未注入阿司匹林组。因而，我们推测 Wnt/β-catenin 通路活性的降低可能是阿司匹林抑制 CCSC自我更新的重要机制。另外，我们将生物素标记的阿司匹林加入到 CCSC（1x106）培养体系中，37%福尔马林固定细胞。用生物素抗体进行免疫共沉淀和Western Blotting，显示阿司匹林可以与 β-catenin直接作用。本课题阐明了Wnt/β-catenin 通路在阿司匹林抑制 CCSC 自我更新中起有重要作用，揭示了阿司匹林与 β-catenin的作用方式，阐明阿司匹林抑制