miR-221～222簇在小鼠胚胎干细胞及诱导性多能干细胞中的功能机制研究

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as critical regulators of embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS) by working at the post-transcriptional level. MiR-221～222 cluster is upregulated during RA-induced embryonic stem cell differentiation and EB formation. Enforced expression of miR-221,222 can suppress the self-renewal in mES cells and meanwhile promote mES differentiation. We also found that miR-221～222 cluster regulates mES differentiation through targeting several transcriptional factors and multiple members of signal pathway responsible for mES self-renewal. We will further study the function and mechanism of miR-221～222 cluster modulating mES differentiation. Since miR-221～222 cluster is enriched in mouse embryonic fibroblast(MEF),we will try to improve the efficiency and pluripotency of iPS cells through suppressing the expression of miR-221～222 cluster during generation of iPS cells from MEF.These works are useful for the committed differentiation of ES cells and the generation of iPS cells.

microRNA作为一类重要的非编码调控分子，在调节胚胎干细胞（ES）自我更新及分化以及诱导性多能干细胞（iPS）产生过程中发挥着重要作用。我们研究发现miR-221～222簇在小鼠ES细胞多种分化模式中均表达上调，且该miRNA簇成员在小鼠ES细胞中的过表达均能明显地抑制ES细胞的自我更新，促进ES细胞向各胚层分化。此外我们鉴定出多个自我更新相关转录因子及关键信号通路分子均为miR-221～222簇的下游靶基因。在以上基础上，本项目将进一步深入研究miR-221～222簇调节小鼠ES细胞分化的功能和机制。且因为miR-221～222簇在胚胎成纤维细胞（MEF）中含量非常丰富，我们将在使用MEF诱导多能干细胞产生过程中抑制该miRNA簇的表达，检测其对于iPS效率及质量的影响。这些工作将丰富miRNA在胚胎干细胞领域的研究，并有助于指导胚胎干细胞的体外定向分化，有助于优化现有的iPS技术。

依照该项目的研究目的——发现在胚胎干细胞（ES，Embryonic stem cell）分化以及诱导性多能干细胞（iPS，induced pluripotent stem cells）产生过程中新的关键miRNA分子，并阐明其机制。利用Dgcr8-/-这一有效的胚胎干细胞系，我们鉴定到14个新的能够抑制胚胎干细胞自我更新的microRNA 分子，根据计划调整情况，将研究重点放在了作用更为显著的miR-27a和miR-24上。深入研究发现miR-27a/24 能够靶向抑制胚胎干细胞多能性维持的关键转录因子（Oct4, FoxO1）和信号通路（gp130,Smads），参与促进胚胎干细胞分化及自我更新程序的沉默。利用新颖高效的CRISPR/Cas9 基因组编辑技术我们在胚胎干细胞中将该microRNA 家族位于不同染色体上的两个Cluster 同时敲除，发现胚胎干细胞向中胚层分化的潜能被严重削弱，说明该microRNA 家族是胚胎干细胞向中胚层分化所必需的；但单独敲除该microRNA 家族中的一个Cluster并不能得到显著的生物学表型，说明microRNA家族或基因簇各成员之间具有功能的冗余性和互补性，因此提出了以microRNA家族或基因簇为单元研究microRNA功能的必要性。另外，在胚胎成纤维细胞中抑制miR-27a/24 的表达能够显著提高其生成诱导性多能干细胞（iPSC）的效率。该研究不仅发现了调控胚胎干细胞分化的关键microRNA分子，同时为明确多种microRNA在胚胎干细胞定向分化过程中的功能研究提供了新的思路和策略。