NKD1在结肠癌细胞中的功能及分子机制研究

Specific tumor diagnostic markers and therapeutic targets are the focus of the basic research of colorectal cancer, while the existed colon cancer tumor markers are less. We detected the clinical tumor and normal tissue samples from patients with advanced colon cancer by RNA-Sequencing and found that NKD1 gene was highly expressed in colon cancer. At present, the mechanism of NKD1 regulating colon cancer is not yet clear. Our study found that peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARD) can up-regulate the expression of NKD1 gene, and the NKD1 promoter contain the conserved PPRE sequence. Mass spectrometry、Immuno- fluorescence and Co-IP Assays showed that NKD1 bound to c-Myc. In addition, MTT, EdU and Clone Formation Assays showed that NKD1 promoted the proliferation of colon cancer cells. Based on this, we proposed the following research plan: 1. The PPARD transcriptionally regulates the expression of NKD1 gene; 2. The NKD1/c-Myc signaling pathway promotes the proliferation of colon cancer cells. This project will provide specific diagnostic markers and therapeutic targets for the diagnosis and treatment of colon cancer.

特异性的肿瘤诊断标志物和治疗靶点是结直肠癌基础研究的热点和重点，而现有的结肠癌肿瘤标志物较少。我们通过转录组测序（RNA-Sequencing）检测中晚期结肠癌患者的肿瘤及正常结肠组织样本，发现NKD1基因在结肠癌特异性高表达。目前，NKD1调节结肠癌的发生及其作用机制尚不清楚。我们研究发现，过氧化物酶体增殖因子激活受体D（PPARD）显著上调NKD1基因的表达，NKD1启动子含有PPARD结合的PPRE保守序列。质谱检测、免疫荧光及免疫共沉淀等实验显示NKD1与c-Myc相互结合。此外，MTT、EdU以及克隆形成等实验，发现NKD1促进结肠癌细胞增殖的功能。在此基础上，我们提出如下研究计划：1. PPARD转录调控NKD1基因的表达；2. NKD1/c-Myc信号通路促结肠癌细胞的增殖。本项目研究将为结肠癌的诊治提供特异性的诊断标志物和治疗靶点。

研究背景：目前，用于结肠癌临床诊疗的肿瘤标志物不仅数量少，且特异性不高。课题组通过对中晚期结肠癌组织和正常结肠组织进行转录组测序，测序结果结合TCGA数据库和GEO数据库统一进行生物信息学分析，发现结肠癌组织中显著高表达的NKD1基因。已知NKD1在一些肿瘤组织中低表达，且因为其抑制Wnt信号通路，被称为Wnt通路抑制因子。而NKD1在结肠癌组织中高表达的相关机制，以及NKD1在结肠癌细胞中的功能尚不清楚。.研究内容：1、筛查结肠癌潜在核心基因；2、分析NKD1在结肠癌细胞中的功能；3、分析NKD1基因的上游调控机制；4、分析NKD1蛋白参与的信号通路；5、分析NKD1促进结肠癌进展的分子机制；6、分析NKD1的相关蛋白DPEP1促进肿瘤进展的作用机制；7、分析NKD1基因的转录因子PPARδ调控肿瘤进展的作用机制。.研究结果：1、转录组测序结果通过生物信息学分析，发现结肠癌组织中显著高表达的NKD1基因。2、功能实验发现NKD1具有促进结肠癌细胞增殖、迁移、浸润和血管生成等方面的功能。3、实验发现PPARδ为NKD1基因的转录因子；且miRNA let-7b-5p通过靶向NKD1基因达到抑制结肠癌增殖的功能。4、酵母双杂交实验发现YWHAE蛋白结合NKD1蛋白，且NKD1通过YWHAE调控结肠癌细胞对葡萄糖的摄取；通过对泛癌组织中NKD1基因表达的分析，发现NKD1高表达的肿瘤组织中NKD1表达与Wnt通路因子表达呈显著正相关，在NKD1低表达的肿瘤组织中NKD1的表达与Wnt信号通路因子的表达呈显著反相关。5、NKD1蛋白促进Dvl与β-catenin蛋白之间的结合，且抑制β-catenin降解并促进其入核；NKD1促进APC蛋白泛素化降解；NKD1抑制c-MYC蛋白自噬降解从而维持肿瘤细胞中c-MYC蛋白的稳定性。6、NKD1促进DPEP1蛋白的表达，DPEP1抑制ASCL2蛋白泛素化降解从而维持ASCL2蛋白在细胞内的稳定性，而ASCL2在转录水平促进DPEP1表达，DPEP1与ASCL2形成正反馈环的方式促进肿瘤进展。7、PPARδ激动剂GW501516显著增强AOM/DSS诱导小鼠的结肠炎相关结直肠癌。PPARδ-S50磷酸化激活PPARδ转录活力，而PPARδ-Y108位点磷酸化会增加PPARδ蛋白稳定性，且促进肿瘤细胞代谢、增殖以及化疗药物的耐受性。