蟹主要过敏原表位解析及表位串联体的构建与表达

The measurement of specific serum immunoglobulin E(sIgE) is an important tool in the diagnostic work-up of suspected food allergy,while known antigens standardization issues seriously affect the accuracy of the results . Each allergies food containing a variety of allergens and differences of individual immune responses, sIgE shows significant heterogeneity in the allegic patients,which has also been confirmed by our previous research to crab allergy sufferers. Using mixture of natural protein as atigens to detect sIgE can not meet the requirements for composition and concentration of all individuals antigens. We assumed that there were a limited number of epitopes in all crab allergen molecules which owed higher binding frequency for sIgE in allergy sufferers. If these epitopes were series connected and recombinant expressed in one protein molecule as atigen, the specificity and sensitivity of serum sIgE test will be effectively improved. By using phage display and protein chip technologies, our project will screen the epitopes with higher binding frequency for sIgE in the serum of clinical definite crab allergy patients. Then the recombinant protein containing these epitopes would be prepared and used as atigen to explored its value in the diagnosis for crab allergy. Our project would open up a new channel for the preparation of high-quality, standardized crab antigens, and improve the clinical diagnosis level for crab allergic diseases.

血清sIgE是鉴别食物过敏原重要指标，而已知抗原标准化问题严重影响结果的准确性。每种过敏食物含多种过敏原，且个体免疫应答存在差异，导致待检sIgE呈明显异质性；此种异质性在我们对蟹过敏患者的研究中得到初步证实。为此采用天然蛋白混合液为已知抗原，不能满足所有个体sIgE对已知抗原组分和浓度的要求。假设在蟹所含的过敏原分子中，存在数量有限的对群体血清sIgE具有较高结合频率的抗原表位；如果将这些抗原表位串联重组、表达在同一蛋白分子中并作为已知抗原，可有效提高血清sIgE检测结果的特异度和敏感度。本项目将在鉴别蟹类所含重要过敏原的基础上，采用噬菌体展示和蛋白芯片技术，以临床明确诊断的蟹过敏患者血清中的sIgE作为"钓饵"，筛选与群体sIgE呈高频率结合的抗原表位，人工制备含这些表位的重组蛋白，探讨作为已知抗原的价值。本项目为制备高质量、标准化蟹已知抗原开辟崭新途径，并提高蟹过敏疾病临床诊断水平。

目的：解析蟹主要过敏原中的关键抗原表位，筛选能够与蟹过敏群体血清sIgE有效结合并具有较高反应频率的抗原表位；构建抗原表位串联体，制备含有主要抗原表位的重组蛋白；分析重组蛋白的免疫活性，研究将其作为已知抗原检测sIgE的可行性和实用价值，从而为制备新型蟹sIgE体外检测试剂奠定基础。.方法：选择蛋白组分全、免疫活性强的蟹蛋白提取方法制备蟹蛋白粗提液，以蟹过敏患者血清为识别抗体，采用酶免疫印迹方法筛选与阳性血清发生反应的显色条带，结合质谱技术分析显色斑点中蛋白组分氨基酸序列并确定新的过敏原组分。同时，采用酶免疫印迹方法，分析不同过敏患者个体血清中sIgE所识别过敏原组分的异质性。采用生物信息学预测过敏原的抗原表位，并将合成肽段以微阵列方式包被在硝酸纤维素膜表面，以蟹过敏患者血清为识别抗体，采用酶促发光免疫印迹方法筛选与阳性血清结合的肽段并确定为过敏原表位。将关键过敏原表位进行串联重组、表达，采用镍柱对目的蛋白进行纯化，并采用斑点免疫印迹和ELISA等方法测定其免疫活性。.结果：用裂解液法提取的蟹蛋白粗提液组分全、重复性好，可用于过敏原的研究；过敏原组学分析结果显示：蟹肉蛋白提取液中含有多种过敏原组分，包括原肌球蛋白等已明确的过敏原，也包括一些未明确的过敏原，分子量较大的蛋白组分与阳性血清同样具有较强反应条带；蟹黄(卵巢)蛋白提取液二维免疫印迹结果显示，蟹黄蛋白同样含有与阳性血清反应较强的显色斑点，结合质谱分析结果证实卵巢发展蛋白是一种蟹黄中的重要过敏原。此外，蟹过敏患者血清中sIgE具有非常明显的个体差异，血清sIgE所识别的蛋白组分不同。采用生物信息学软件预测原肌球蛋白的3个表位，进行串联表达、纯化，且目的蛋白能与蟹过敏患者反应，具有较好的免疫学活性。用生物信息学软件预测10个血蓝蛋白的抗原表位，通过斑点印迹实验结果证明，1、2、4肽段反应频率最高。将1、2、4号肽段的碱基序列串联表达。.结论：血清sIgE检测结果的准确性很大程度上依赖包被抗原组成和相对比例，血清中sIgE所针对的过敏原存在异质性是影响血清sIgE检测结果的准确性的重要因素之一；利用重组技术获得过敏原表位重组蛋白具有产量高、质量高、均一性好等优点，且能与蟹过敏患者血清显示较好的反应性，有望作为血清sIgE检测的已知抗原并取代天然蛋白混合物，提高蟹过敏疾病的临床诊断水平。