calponin-3介导的树突棘重塑在耐药性癫痫形成中的功能研究

Drug-resistant epilepsy is a chronic disorder and can have devastating consequences.Lines of evidence have shown that aberrant neuronal network.may contributes to medical intractability, although the underlying mechanism remains unclear. Calponin-3, an actin-binding parter,is localized in the dendritic spines, which are highly dynamic structures.Calponin-3 with actin filament reduces the sliding of actin on myosin, leading to depressed retraction of spine heads.Our previous study showed that up-regulation of calponin-3 in the brain from the patients with drug-resistant epilepsy might be related to seizures, and the change of calponin-3 in the brain of epileptic rats showed a similar trend.Thus, in future study, we will investigate the changes of epilepsy susceptibility， neuronal excitability and dendritic spines shape and motility in the rats, hippocampal neurons and cortical neurons after up-regulation or silence of calponin-3 expression. This study aims to determine the role of abnormal calponin-3 expression in the epilepsy and to furture understand the pathogenesis of drug-resistant epilepsy.

耐药性癫痫是严重危害人类健康的慢性疾病,越来越多的证据显示异常神经元网络是关键的致病因素，但其形成的具体环节尚未查明。集中在神经元突触后膜的肌动蛋白结合蛋白calponin-3通过抑制树突棘头的回缩而可能促成新的兴奋性突触形成。我们前期试验观察到calponin-3在耐药性癫痫患者脑内的过表达可能与痫性发作相关，且其在癫痫鼠脑内也有相似的改变趋势。基于这些现象，本研究拟进一步采用基因沉默和过量表达、免疫印迹、免疫染色和膜片钳技术，从动物整体、组织和细胞层面上，观察实验鼠脑内calponin-3异常表达对其癫痫易感性和神经元形态的影响，以及不同癫痫细胞在calponin-3表达改变后神经元兴奋性和树突棘形态、运动的变化，旨在诠释神经元calponin-3表达改变与痫性发作间的因果关系和可能的环节。本研究将有助于深化对耐药性癫痫发病机制的认识，为提高耐药性癫痫的诊治水平开辟新思路。

神经元间异常网络形成是耐药性癫痫的重要病因，其形成基础之一是突触重塑。树突棘是构成脑内谷氨酸能突触后膜的主要部分，接收神经元胞体传入的兴奋性冲动。神经元的calponin-3主要集中在树突棘，调控树突棘的运动，参与突触重塑。课题组前期观察到calponin-3在耐药性癫痫患者及癫痫模型鼠的脑内异常表达，可能与癫痫相关，但具体角色及作用环节不详。本研究完成了设计、构建和包装大鼠CNN3的过表达和RNAi慢病毒质粒，制备海马CNN3基因表达沉默/上调鼠，再注入氯化锂和匹鲁卡品诱发癫痫，通过行为学观察和脑电图评估；然后利用分子生物学、膜片钳及透射电子显微镜检测组织calponin-3表达与神经元放电及突触结构功能的相关性；为进一步验证，又采用慢病毒转染原代培养的海马、皮层神经元以沉默/过表达CNN3基因，放入有/无镁脑脊液中孵育，通过单细胞膜片钳技术记录正常神经元及癫痫细胞的静息电位和癫痫样放电。研究显示，上调海马内calponin-3表达使实验鼠在注入40mg/kg匹鲁卡品后出现癫痫发作的潜伏期显著缩短，海马的突触小泡及突触连接增多、神经元的树突棘延长、P-NMDAR1和PSD-95水平显著升高；calponin-3过表达的原代海马和皮层神经元在无镁脑脊液中出现癫痫样放电显著增多。这些结果在国内外首次表明calponin-3异常表达改变实验动物对致痫刺激的易感性和神经元兴奋性，作用环节包括神经元树突棘、突触连接及部分兴奋性氨基酸受体、突触后致密物等，扩充了对突触重塑和癫痫发病机制的认识，为提高耐药性癫痫的诊治水平开辟新思路。