鲎抗内毒素因子模拟肽诱导小鼠“内毒素耐受”的机制研究

鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可中和内毒素，显著提高内毒素休克小鼠的生存率；项目前期研究表明模型肽尚可预防性提高小鼠对脓毒症的抵抗及降低LPS对巨噬细胞的致炎作用，抑制IL-1β刺激所诱导的炎症因子升高；且可与胞膜结合，上调细胞趋化因子表达，提示CLP-19在胞膜上存在作用靶点，并通过该靶点诱导内毒素耐受，然机制尚待研究。本研究拟通过基因芯片和信号通路芯片、免疫印迹、ELISA法比较研究CLP-19诱导内毒素耐受细胞基因、蛋白及信号通路变化；及耐受后对细胞增殖、吞噬功能的影响；并通过GST-pull down技术捕获与胞膜的结合蛋白，分离并质谱鉴定，结合信号通路结果筛选靶蛋白，构建siRNA，以验证该靶点在CLP-19诱导内毒素耐受中的作用；并通过脓毒症模型鼠验证。以最终明确CLP-19诱导内毒素耐受机制，为该肽用于脓毒症预防提供理论依据；并为设计和开发类似肽及其靶向新药奠定基础。

通过本课题的实施，系统研究了鲎抗内毒素因子CLP-19诱导内毒素耐受的机制，具体完成情况如下：.1. CLP-19预处理内毒素血症小鼠，可显著诱导内毒素耐受，提高小鼠的生存率，降低TNF-a水平及肺部炎性损伤，该作用呈显著的时间依赖现象。.2. CLP-19与RAW 264.7细胞免疫调节作用 50ug/ml CLP-19预处理巨噬细胞20h后，炎症因子IL-6表达下调，抗炎因子IL-10表达增加。.3.CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的分子机制研究.CLP-19预处理细胞，随刺激时间的延长，TLR4 mRNA表达下调，而MyD88和TRAF6 mRNA水平无明显变化。.4. 完成实验所需CLP-19的合成、修饰、结构与活性研究.5. CLP-19与RAW 264.7细胞特异性结合蛋白的鉴定和作用特征.多肽亲和色谱和质谱分析鉴定CLP-19主要结合蛋白为α/β微管蛋白，该结果被免疫印迹和免疫荧光法所验证。同时还证明CLP-19可以和微管蛋白直接、特异性结合，且该结合受盐离子浓度的影响较小。.6. CLP-19与RAW 264.7细胞微管蛋白结合发挥免疫调节作用的机制.CLP-19不仅增加了微管组装的最大速率和聚合量，也消除了组装的成核阶段。还发现CLP-19在预孵育15 h范围内可时间依赖性降低LPS所致的TLR4和TNF-α高表达，表明体外最佳预保护时间为15 h。.研究结论.1. CLP-19在体预处理小鼠，可诱导小鼠产生内毒素耐受，显著提高内毒素血症小鼠的生存率.2. 50μg/ml CLP-19预处理RAW264.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。.3. CLP-19可通过降低TLR4在胞膜和胞内的表达、抑制P38磷酸化及抑制IκBα和IκBβ的降解诱导内毒素耐受。.4. α和β微管蛋白为CLP-19在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的特异性结合蛋白。.5. CLP-19作用于微管可干扰其动力学平衡，降低微管依赖性TLR4囊泡运输效率。.6. CLP-19可通过降低细胞表面TLR4受体的表达抑制LPS对巨噬细胞的刺激。.研究共完成论文8篇，已发表论文6篇（其中SCI论文3篇，核心期刊3篇），已投稿SCI论文2篇；申请发明专利1项。培养博士3名，其中1名获重庆市优博论文；硕士1名。