去泛素化对哺乳动物精子顶体素活化、卵母细胞透明带硬化及多精入卵的影响

Mammalian spermatozoa lose their activity in the process of cooling , called" cold shock". This phenomenon leads to death of many spermatozoa or loss of vitality, the mammalian germplasm resources preservation to our country brings great hidden danger. Generally considered, low fertilization rate for "cold shock" sperm is because sperm suffer the injury in the cooling process of low temperature, including "capacitation-like"change,called cryo-capacitation.Capacitationand"capacitation -like"sperm have many similarities, but capacitation sperm can normal fertilization, and" capacitation-like" sperm have low fertility or loss of fertility, the differences has not been reported. Therefore, we mainly study effects of de -ubiquitination on acrosin activation, ZP (zona pellucida ,ZP)hardening and polyspermy, on the basis of this study Through the comparison of" acrosin activation pathway differences of capacitation" and" capacitation-like" sperm , clarify" The reason of low fertility of capacitation-like" sperm , for the improvement of mammalian sperm freezing efficiency and reduce polyspermy provides effective measures. The studies show that after the freezing injury of sperm fertilization has repair mechanisms, but the repair is limited, often resulting in late developmental defects. The completion of this project will provide a theoretical basis for improving preservation of mammalian germplasm resources, reduction of cryoinjury sperm and cure of sterility infertility.

哺乳动物精子在迅速冷却时失去活力，称之为"冷休克"。这种现象导致精子大量死亡或丧失活力，给我国哺乳动物种质资源保存带来巨大的隐患。普遍认为"冷休克"精子受精率下降是因为精子冷却过程中遭受了低温损伤，这种损伤包括"获能样"变化，称之为低温获能。获能与"获能样"精子间有许多相似之处，但获能精子能正常受精，而"获能样"精子受精力低或丧失受精力，产生这种差异的研究未见报道。因此，我们主要研究哺乳动物精子去泛素化对顶素体活化、透明带硬化及多精入卵的影响，在此研究基础上通过比较"获能"与"获能样"精子顶体素活化途径的差异,阐明"获能样"精子受精能力低的原因,为改善哺乳动物精子冷冻效率及降低多精入卵提供有效措施。研究表明尽管冻伤精子受精后有损伤修复机制，但这种修复是有限的，往往导致后期发育的缺陷。本项目的完成将为改进哺乳动物种质资源保存，降低精子低温损伤以及不孕不育治愈等方面提供理论依据。

研究显示，哺乳动物精子顶体酶抑制剂（AI）和卵母细胞透明带（ZP）分别在获能和成熟过程中都发生泛素化修饰，最终被精子26S顶体蛋白酶降解。因此，本研究的主要内容是去泛素化对顶体素活化、透明带硬化及多精入卵的影响。项目的完成为改善哺乳动物精子冷冻效率及降低多精入卵提供理论数据。.我们的研究结果如下：.1、sp32作为一种前顶体蛋白结合蛋白，在前顶体蛋白活化过程中sp32的表达水平及酪氨酸磷酸化水平显著上调（P<0.05）。.2、不同处理结果表明，大约在41kDa、30kDa、12kDa处的蛋白发生了泛素化；冷休克处理组蛋白泛素化的表达量较其它三组明显下降.结论：获能和顶体反应处理组泛素化水平显著高于鲜精和冷休克处理组（P<0.05）。 .3、猪卵母细胞体外培养46、52、58及64 h后，ZP蛋白大约在65 、85和120 kDa 处标记出泛素化蛋白。培养46h组的ZP1蛋白的泛素化水平显著高于52 h、58 h和64 h组（P<0.05）。.4、GV期卵母细胞体外成熟培养过程中，ZP1、ZP2、和ZP3蛋白发生了不同程度的泛素化。ZP1发生了4个泛素化,ZP2发生了2个泛素化,ZP3发生1个泛素化，表明精子入卵时26S蛋白酶体需要降解ZP1。.5、GV与MⅡ期猪卵母细胞ZP蛋白泛素化条带进行灰度值分析，GV与MⅡ期猪卵母细胞透明带蛋白均发生了不同程度的泛素化，且MII组ZP1、ZP2和ZP3蛋白泛素化水平显著高于GV期。.6、在体外获能液中添加(0μM，10μM，20μM，25μM，30μM及DMSO阴性对照组）UCHL-1抑制剂体外受精4h，UCHL-1抑制剂处理组，AI水平显著高于对照组（P<.05）；而体外受精率显著低于对照组（P<0.05）。.7、在成熟培养液中添加浓度（0μM，10μM，20μM，25μM，30μM及DMSO阴性对照组）UCHL-1抑制剂后成熟培养，结果显示除30μM UCHL-1抑制剂的处理组以外，其余各组的ZP在约65kDa，85kDa，120kDa处均发生不同程度的泛素化标记，差异显著（P<0.05）.8、试验分对照组（未添加PMSD4抗体）和处理组（添加PMSD4抗体），对照组大约约在65 kDa、85 kDa和120 kDa处标记出ZP蛋白泛素化；处理组在120 kDa处未标记出ZP1蛋白泛素化，而