雄激素对TET介导的卵母细胞去甲基化影响及传代效应机制研究

Gametes are extremely susceptible to adverse environmental influence especially endocrinology disturbance during development, increasing the chance for "gamete origin of adult disease". Follicular hyperandrogenism, the most common endocrinology disorder for reproductive aged women, leads to ovulation failure and even jeopardizes the health of offspring, however, the underlying mechanism is still unclear. We have previously found out that follicular hyperandrogenism could alter the methylation status in MII oocyte. Here, we plan to further study the effect of androgen on the process of demethylation in oocyte mediated by TET and also the transmission effect to the next generation. We are going to use the established hyperandrogenic rat model, screening the oocyte global hydroxymethylation/methylation level by oxBS-Seq and genomic gene expression file by mRNA-Seq; predicting the candidate genes among glucose metabolism related pathways by bioinformatic analysis; detecting the expression and methylation alteration of TET and candidate genes of hyperandrogenic IVM oocyte by immunofluorescence/confocal; observing the effect of TET in cell line by knock-down; exploring the androgen receptor transcriptional regulation of TET by ChIP; and also detecting the hydroxymethylation change in offspring by Mspl-QPCR. With these studies above, we want to provide academic evidences to the theory of gamete original epigenetic modification induced by adverse endocrinology.

不良环境尤其是内分泌干扰极易对配子造成损伤，引发"配子源性成人疾病"。卵泡局部高雄激素可造成排卵障碍，威胁子代健康，但机制不详。本项目在前期发现卵泡局部高雄可致卵母细胞甲基化改变的基础上，拟深入研究雄激素对TET介导的卵母细胞去甲基化影响及传代效应机制。将利用已建立的高雄大鼠模型，通过oxBS-Seq从全基因组层面筛查高雄所致卵母细胞差异羟甲基化/甲基化；利用mRNA-Seq定量筛查高雄所致卵母细胞基因表达差异；通过生物信息学分析预测筛选重要通路中候选靶基因；免疫荧光/激光共聚焦显微技术检测未成熟卵高雄作用下甲基化水平、TET及靶基因改变；体外细胞培养，通过敲减TET明确其在高雄干扰甲基化中关键作用；利用ChIP及荧光素酶报告分析高雄对TET转录调控分子机制；获取子代靶细胞检测羟甲基化水平，探讨相应传代效应机制。为相关环境内分泌干扰物致配子源性表观遗传改变机制的研究开拓思路，提供理论基础。

研究背景：生命早期事件能够影响个体一生的健康。配子阶段的不良环境暴露可增加子代出生后成年期慢性疾病的易感性，但发病机制不清。本课题组在前期建立了卵子发育阶段的卵泡局部高雄大鼠模型的基础上，选择与糖尿病发病密切相关基因Igf2，研究高雄激素对卵母细胞表观遗传的影响及关键表遗传修饰的传代效应，为以高雄暴露为代表的配子阶段的环境内分泌干扰物致子代表观遗传改变的分子机制研究提供理论基础，为2型糖尿病等重大代谢性疾病的源头干预开拓研究思路。.研究内容：1.高雄激素症子代随访。2.高雄激素对卵母细胞及出生子代外周血靶基因甲基化及表达水平的影响。3. 孕前高雄激素大鼠子代的表型观察。4. 大鼠卵泡内局部高雄激素影响卵母细胞甲基化致子代表观遗传改变的传代效应研究。.结果：1. 高雄激素症妇女出生子代在儿童期即表现出升高的空腹血糖水平及HOMA-IR指数，高雄子代前驱糖尿病发生风险显著高于非高雄子代。2. 体内局部高雄的卵母细胞Igf2表达水平显著上升，高雄激素处理上调人卵母细胞Igf2表达水平。同时，高雄激素母亲出生子代的外周血细胞中母源性印记基因Igf2表达水平同样升高， Igf2基因DMR区的甲基化水平降低。3.妊娠前高雄暴露雌鼠的子代在幼年期即出现了空腹血糖水平升高，部分子代出现糖尿病，同时葡萄糖刺激后的胰岛素分泌水平减低，并持续至成年期。4. 高雄激素上调大鼠卵母细胞中Igf2的表达，Igf2在高雄子代胚胎时期胰岛细胞中的表达也同样上升。Igf2基因的DMR2区在亲代卵母细胞及子代胰岛细胞中甲基化水平均降低，其中有3个CpG位点出现了同样的低甲基化修饰..科学意义:母亲妊娠前高雄暴露出生子代具有糖代谢异常表型，其中高雄所致的母源性印记基因IGF2甲基化改变的代间传递可能是其表观遗传学机制之一。