小分子调控DNA甲基化的结构与功能研究

DNA methylation is an important epigenetic modification. TET proteins oxidize methylation of DNA and play important roles in regulation of embryo development, cellular programming and re-programming..The applicant previously report crystal structure of TET2 in complex with 5mC-modified DNA, which reveals the molecular mechanisms of substrate recognition and catalysis by TET2 (Cell, 2013). Previous studies and data from our groups indicate that small molecules, such as ATP, Vitamin C and α-KG analogues, could active or inhibit TET dioxygenases activity. Particularly，some metabolites heavily accumulated in tumors，which are tightly associated with tumorgenesis through regulating epigenetic modification enzymes. The exploration of this phenomenon will have profound significance in understanding the mechanism of TET-mediated regulation of DNA methylation by small molecules。 .We here proposed to determine the crystal structure of TET in complex with these small molecules. The studies will reveal mechanisms by which small molecules regulate DNA methylation through modulating enzymatic activity of TET proteins. The accomplishment of this project will also lay a solid structural foundation for discovering agonists or antagonists of TET proteins.

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰。TET蛋白氧化DNA甲基化并参与DNA去甲基化过程，在胚胎发育，表观遗传调控的细胞编程与重编程过程中起作用。申请人前期工作解析了TET2-DNA复合物晶体结构，揭示了TET蛋白识别和催化DNA甲基化的分子机制(2013,Cell，唯一通讯作者)。以往研究及申请人前期工作发现多种小分子，如维他命C，ATP和α-KG类似物等，能够显著影响TET蛋白酶活性，调控DNA甲基化的动态变化。某些代谢小分子在肿瘤中大量累积，引起DNA甲基化紊乱导致肿瘤。本项目拟解析TET蛋白与多种小分子复合物的晶体结构，通过结构与功能研究，阐明小分子激活或抑制TET蛋白酶活性的分子机制，项目的完成将深入揭示小分子通过TET蛋白酶活性，参与DNA甲基化动态调节的分子机制，并为设计和开发靶向TET蛋白的药物奠定重要的结构生物学基础。

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰。TET蛋白氧化DNA甲基化并参与DNA去甲基化过程，在胚胎发育，表观遗传调控的细胞编程与重编程过程中起作用。本项目预期目标是解析TET蛋白与多种小分子复合物的晶体结构，通过结构与功能研究，阐明小分子激活或抑制TET蛋白酶活性的分子机制，项目的完成将深入揭示小分子通过TET蛋白酶活性，参与DNA甲基化动态调节的分子机制，并为设计和开发靶向TET蛋白的药物奠定重要的结构生物学基础。.在小分子调控TET活性的研究中，项目组发现ATP以及其他核苷酸，如GTP，CTP等，可以明显激活TET的酶活性。由于ATP与TET蛋白的结合能力非常弱（ KD>1mM），未能获得复合物的晶体结构。后续经过荧光、SPR（表面等离子共振技术）等方法检测，发现ATP是通过促进TET蛋白与底物DNA的结合动态性来促进TET酶活性的。该项工作正在整理投稿。.在小分子调控TET活性的另一项研究中，项目组研究了VC激活TET的分子机制。我们的初步研究发现：VC结合到TET的催化活性中心，并且“在位”还原Fe3+离子，使反应能够加速进行。该项研究还需要结构生物学和分子动力学的进一步支持和验证，如果确证改假设，将为VC调控双加氧酶的机制研究提供新的思路。.在TET的酶活性偏好性机制研究中，项目组发现TET蛋白对三种DNA底物有明显的活性差异，就是对5mC的活性很高，而对5hmC，5fC的活性很低。通过结构和生化及动力学研究发现：在发生氧化反应中，5hmC、5fC在催化中心受到限制，不容易发生消氢作用，因此呈现活性低，而5mC中C-C键可以自由旋转，三个氢原子可以指向催化的最优化方向（Nature, 2015b）。这一研究很好的证明了细胞内5hmC的水平远远高于5fC和5caC，说明5hmC，5fC相对稳定而不容易发生氧化反应。TET蛋白更容易产生5hmC。