基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的加味逍遥散乳腺癌化学预防机理的研究

乳腺癌是一种通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，绝大多数乳腺癌可以通过积极的化学预防而有效避免。合成化学预防剂存在的最突出问题是预防机制单一、毒副作用大。中药方剂毒副作用低，特别是具有多组分、多靶点作用特点，在多病因的乳腺癌防治中显示出巨大的优势，但大多数作用机制不明。本项目选择加味逍遥散及其经过肠吸收和细胞膜色谱柱的成份组作为研究对象，探索其乳腺癌化学预防的作用机理。拟利用基因芯片技术，构建经研究对象干预不同特性的乳腺上皮细胞模型前后的mRNA表达图谱，应用生物信息软件比对差显表达基因，发现受到调控的信号通路- - Keap1-Nrf2-ARE，进一步筛选该通路中涉及乳腺癌预防的相关目标基因，初步探索目标基因受调控的机理，揭示特定目标基因与雌激素受体的关联性，结合细胞功能学试验和整体动物实验，为系统地阐明加味逍遥散预防乳腺癌的机理和筛选中药乳腺癌化学预防剂奠定理论基础，开阔研究思路。

本研究首先制备了MXP模拟肠吸收液，并通过文献查阅，整理出MXP中可能存在的有效成分。再通过报告基因系统，筛选出能够明显诱导ARE荧光素酶活性的单体有效成分。ARE荧光素酶报告基因系统实验的结果显示，MXP与其单体成分槲皮素(Q)、异鼠李素(I)、山奈酚(K)、白术内酯II(A)及熊果酸(U)具有很强的ARE荧光素酶诱导作用。同时，研究了MXP及其潜在有效成分对乳腺癌细胞Nrf2通路相关基因表达水平的影响。.继而，为了验证MXP在乳腺癌的发生发展过程中与Nrf2的关系，我们构建了MCF-10A(Nrf2-/-)细胞，并结合软琼脂集落形成实验，考察了MXP、Q、K和A对于17β-雌二醇（E2）诱导的MCF-10A及Nrf2敲除细胞的癌变过程中的抑制作用。结果显示，药物对MCF-10A的癌变均有明显抑制作用，而在Nrf2敲除的细胞中作用并不明显。研究结果初步证明Nrf2转录因子在乳腺癌化学预防过程中的重要性。.本项研究进一步构建了转染ERα和ERβ的MDA-MB-231细胞系，并通过免疫共沉淀研究ER与Nrf2信号通路的关联性。结果显示，MXP对于ERα具有显著的下调作用，同时对于ERβ具有显著的上调作用，且ER与Nrf2信号通路存在关联性。以上结果提示MXP可以通过对Nrf2信号通路的影响从而对ER进行调节。.最后，我们采用MNU建立SD大鼠乳腺癌模型，以及MDA-MB-231细胞接种建立裸鼠异种移植瘤模型，考察MXP在体内对于原发性和异种移植乳腺癌的化学预防作用。试验对肿瘤组织形态学、肿瘤标记物、目标基因检测进行药物体内作用的研究。结果显示，MXP组的肿瘤体积和重量明显小于空白对照组，且MXP组肿瘤组织中的肿瘤标记物mRNA水平有显著性的下降，显著激活了Nrf2信号通路并调节了ER的mRNA表达水平。.本研究的整体结果表明，MXP具有化学预防的作用，其中一个重要机制可能是通过Nrf2通路的激活而产生的。本研究从分子生物学水平上探究了MXP对乳腺癌细胞中Nrf2通路相关蛋白与mRNA的表达的影响，建立体外和体内的乳腺癌发生模型。初步揭示了MXP对乳腺癌发生过程中的抑制作用及抑制机理，研究工作同时考察了加味逍遥散中可能存在的潜在有效成分，从而为Nrf2激活剂的研究提供了新的选择。研究工作按照项目计划书的研究目标和研究内容进行，完成了项目计划书所列研究任务。