突变型E1A基因调节p21CIP1/WAF1的表达及其介导的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用研究

野生型腺病毒E1A能够结合于Rb蛋白，使得E2F从Rb-E2F转录复合物中解离出来，细胞进入S期、进程加快，针对这一特性，双缺失突变E1A保守域的30-60和120-127位氨基酸，使其失去与Rb的结合能力，保护Rb的抗肿瘤作用，同时将其置于肿瘤高特异性Ki67启动子调控之下，构建一种肿瘤特异性的突变型溶溜病毒。.腺病毒的增殖和宿主细胞周期相关，其关键基因E1A能够影响细胞中p21CIP1/WAF1的表达，p21CIP1/WAF1是细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制子，抑制CDK和增殖细胞核抗原的活性，抑制Rb的磷酸化，阻止细胞周期进程和DNA复制。此外，p21CIP1/WAF1作为细胞因子能对腺病毒活性产生影响。 .本课题将研究：1）双位点突变型E1A介导的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用；2）突变型E1A与Rb/E2F、p21CIP1/WAF1之间的相互调控作用及这些细胞因子对腺病毒活性的影响。

溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus)指经基因工程改造，能够在肿瘤细胞内复制并将其杀伤，释放出子代病毒继续发挥作用的一类腺病毒。E1A是调控腺病毒复制的关键基因。本项目构建由肿瘤特异性Ki67启动子调控腺病毒E1A或者突变型E1A基因（mE1A, 失去与Rb的结合能力）溶瘤腺病毒；研究该病毒对肿瘤细胞、荷瘤裸鼠的影响。体外实验证实E1A病毒能抑制肿瘤细胞Hela、Ketr-3的增殖。E1A病毒分别感染Hela细胞、KETR-3细胞及正常HK-2细胞后，Western Blot检测发现在这三种细胞均能检测到E1A、mE1A蛋白的表达，并且E1A能上调p53、p21的表达。CCK-8法、结晶紫染色法显示E1A病毒对Hela细胞、KETR-3细胞均有杀伤、增殖抑制作用，呈浓度及时间依赖性。裸鼠肾癌移植瘤实验证实E1A介导的腺病毒能抑制肿瘤细胞生长。本研究为E1A介导溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗提供理论基础。