Kupffer细胞中氧化mtDNA介导FFA激活NLRP3炎症小体的分子机制研究

The change from simple steatosis to nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is a key step in the development of nonalcoholic fatty liver disease, and IL-1β plays an important role in the process of hepatic lipid metabolism disorder. The maturation and secretion of IL-1β is closely related to the activation of NLRP3 inflammasome. The agonists of NLRP3 inflammasome could not activate the NLRP3 inflammasome directly. Thioredoxin-interacting protein (TXNIP) is the only protein which could bind and activate NLRP3 inflammasome. However, in our preliminary study, we find that the KCs of TXNIP knock-out mice could still secrete IL-1β, indicating that free fatty acid (FFA) could activate NLRP3 inflammasome through other signal pathway. Recently some researchers find that oxidized mitochondrial DNA (mtDNA) might be an important bridge which bridges the agonists and NLRP3 inflammasome. Consequently, we reckon that FFA could activate NLRP3 inflammasome through oxidized mtDNA. In this research, we take the Kupffer cell as the major target cell, and discuss the mechanism of the activation of NLRP3 inflammasome by oxidized mtDNA in Kupffer cell, to further study the pathogenesis of NASH.

单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎为非酒精性脂肪性肝病发展过程中的关键步骤，IL-1β在肝脏脂代谢紊乱过程中发挥重要作用，其成熟及分泌与NLRP3炎症小体的激活密切相关，NLRP3炎症小体的激动剂均不能直接激活该炎症小体，硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）是目前发现的唯一可与其结合并导致其激活的蛋白。我们前期研究发现TXNIP-/-小鼠Kupffer细胞（KCs）受到游离脂肪酸刺激后仍可产生IL-1β，说明游离脂肪酸还可通过其它通路导致NLRP3炎症小体激活。最近研究发现氧化线粒体DNA可能为连接激动剂与该炎症小体的重要桥梁。因此，我们推测游离脂肪酸亦可通过KCs中氧化线粒体DNA与NLRP3炎症小体结合导致其激活。本研究以KCs为靶细胞，通过免疫共沉淀及基因敲除等方法，探讨氧化线粒体DNA在介导游离脂肪酸激活KCs中NLRP3炎症小体的确切机制，为进一步研究脂肪性肝炎的发生机制做一些探索性工作。

单纯性脂肪肝发展为NASH为NAFLD发展过程中的关键步骤，IL-1β导致的肝脏慢性炎症在这一过程中发挥重要作用。我们认为KCs是肝脏中各种应激刺激导致NLRP3炎症小体激活并分泌IL-1β的主要部位，研究KCs中NLRP3炎症小体的激活机制对于阐明NASH的发病机制具有重要意义。本研究中，我们以肝脏KCs为靶细胞，研究高FFA状态下KCs中氧化mtDNA与NLRP3炎症小体的相互作用关系，探讨KCs中氧化mtDNA介导FFA激活NLRP3炎症小体的确切机制。主要有以下重要发现：.1. H&E染色发现NASH组WT小鼠肝组织中F4/80及NLRP3的表达水平较对照组明显增高，表明KCs与NLRP3参与NASH的发生发展。.2. H&E染色及油红O染色发现MCD饲料可以诱导典型的NASH小鼠模型，肝细胞内有较多脂滴形成，并伴有小叶内炎症及气球样变，敲除NLRP3基因可明显抑制MCD诱导的小鼠肝损伤，阻止NASH形成。.3. 敲除小鼠NLRP3基因可以明显抑制MCD饲料诱导的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及促炎因子IL-1β的升高，改善肝功能。.4. NASH小鼠肝脏KCs中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达水平明显增高，并可形成蛋白复合物，敲除NLRP3基因可明显下调小鼠肝脏KCs中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达水平，并抑制蛋白复合物的形成。.5. FFA刺激可降低KCs的膜电位，促进mtDNA从线粒体释放至胞质。.6. FFA刺激WT小鼠KCs可上调NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达水平，促进mtDNA与NLRP3炎症小体形成蛋白复合物，敲除NLRP3基因可明显下调KCs中NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达水平，抑制复合物的形成。.7. FFA刺激可导致WT小鼠KCs中Caspase-1的酶活性明显增高及促炎因子IL-1β的水平增高，敲除NLRP3基因可明显抑制以上两个指标的上调。.综合以上，本项目从动物及细胞水平探讨了mtDNA及NLRP3炎症小体在NASH发病中的作用及具体机制，证实了mtDNA可通过ROS依赖机制释放至胞质与NLRP3炎症小体结合并导致其激活，促进促炎因子IL-1β的水平增高，参与NASH的发生发展。