组织蛋白酶B调控Kupffer细胞中caspase-11非经典NLRP3炎症小体激活的机制研究

As a general rule, lipopolysaccharide only activates the macrophage by recognizing with Toll like Receptor 4 (TLR4). However, our previous work have found that blocked TLR4 signaling pathway did not completely eliminate the LPS signal recognition and conduction. This data suggested that in addition to the TLR4, there may be other signaling pathways. Recently studies have found that cytoplasmic LPS could activate non-canonical NLRP3 inflammasome in a TLR4-independent way. And Cathepsin B (Cathepsin B) may regulate non-canonical NLRP3 inflammasome pathway by moudulating the activaty of caspase 11, but the specific mechanism is unclear. Therefore, in our research, we will administrate LPS to the TLR4-/-mice and Kupffer cells with the inhibitors of CathepsinB or CathepsinB siRNA pretretment, detect Cathepsin B gene and protein expression level and Cathepsin B outflow from lysosome in Kupffer cells as well as activation of non-canonical NLRP3 inflammasome. Our study will provide the experimental basis for whether Cathepsin B participates in in the non-canonical NLRP3 inflammasome and the molecular mechanism in KCs.activation.In this study will provide KCs Cathepsin B whether to participate in, and how to participate in the classic inflammatory corpuscle NLRP3 activation to provide experimental basis.

通常认为，LPS只能与TLR4结合后才能将刺激信号传导至细胞内。本课题组前期研究发现，阻断TLR4信号通路并不能完全阻断LPS信号的识别与传导，表明除了TLR4以外，可能还存在其它信号通路。研究显示，进入胞质内的LPS可以激活 caspase11非经典NLRP3炎症小体；组织蛋白酶B （Cathepsin B）可能通过调节caspase11的激活参与非经典NLRP3炎症小体的活化，但具体机制还不清楚。因此，我们将在给予Cathepsin B酶活性抑制剂或Cathepsin B siRNA预处理后，用LPS 刺激TLR4-/-小鼠及Kupffer细胞（KCs），检测Cathepsin B基因、 蛋白表达水平、酶分布变化，以及 caspase11介导的非经典NLRP3炎症小体激活情况。本研究将为KCs中Cathepsin B是否参与以及如何参与非经典NLRP3炎症小体的激活提供实验依据。

最近研究发现，阻断TLR4信号通路并不能完全阻断LPS信号的识别与传导，表明可能还存在其它信号通路。研究显示，进入胞质内的LPS可以激活 caspase11非经典NLRP3炎症小体；组织蛋白酶B （Cathepsin B）可能通过调节caspase11的激活参与非经典NLRP3炎症小体的活化，但具体机制还不清楚。本项目细胞实验内容为：从TLR4-/-和野生型（WT）小鼠肝脏中分离培养KCs，给予Cathepsin B 抑制剂预处理后，分别用小剂量（10ng/ml）及大剂量LPS(10ug/ml)刺激，观察细胞内Cathepsin B基因、 蛋白表达水平及Cathepsin B酶活性变化；检测 casepase-11及caspase-1激活水平。我们发现：①小剂量LPS刺激，WT 及 TLR4-/- KCs 胞质内Cathepsin B活性均未见明显改变；大剂量LPS刺激，WT 及 TLR4-/- KCs 胞质内Cathepsin B活性增加。②小剂量LPS刺激，WT 及 TLR4-/- KCs内 caspase-11信号通路未见明显激活；大剂量LPS刺激时KCs中caspase-11信号通路激活。③抑制Cathepsin B活性或下调Cathepsin B表达后，WT 及 TLR4-/- KCs 内caspase-11激活水平明显降低。本项目动物实验内容：利用TLR4-/-及WT小鼠，给予Cathepsin B酶活性抑制剂后，建立脓毒症模型，观察小鼠存活率情况；检测肝脏中Cathepsin B酶活性变化以及casepase-11信号激活水平。我们发现：①脓毒症WT 及TLR4-/-小鼠KCs中 caspase-11信号激活增，Cathepsin B活性明显升高。②给予Cathepsin B抑制剂预处理，可提高小鼠生存率，降低LPS刺激引起的Cathepsin B活性增加， caspase-11的激活以及血浆炎症因子的水平。综上所述，本项目研究结果提示：在活体动物及细胞中，Cathepsin B能够激casepase-11，进而导致非经典NLRP3炎症小体活化。抑制Cathepsin B酶活性或者下调Cathepsin B蛋白表达后，能够对内毒素血症动物和感染LPS的KCs产生保护作用。项目研究结果将为治疗炎症相关性疾病提供实验依据。