抑癌基因ZHX2调控肝癌细胞中DNMT3B表达的分子机制研究

Zinc-fingers and homeoboxes 2 (ZHX2) protein is a transcriptional repressor and functions as a tumor suppressor gene (TSG). The gene chip and ChIP-on-chip analysis showed that ZHX2 may regulate the transcriptional expression of DNA methyltransferase 3B (DNMT3B), an epigenetic gene. DNMT3B was abnormally high expressed in different types of human cancers, including hepatocelluar carcinoma (HCC). The chemical agents, azacitidine and decitabine, targeting DNA methyltransferase (DNMT) have been used for clinical treatment for haematological malignancies. However, early clinical trials showed that these DNMT inhibitors have low anticancer activity and significant toxicity in different solid tumors, including HCC. In this study, we will try to explore the mechanism of ZHX2 regulating DNMT3B expression, including the cis-acting element in the DNMT3B promoter and trans-acting functional domains of ZHX2.And we will also study the effect on the methylation level of TSGs' promoter. Our study should be helpful to develop biological inhibitors of DNMT for HCC therapy.

ZHX2是一个具有锌指结构和同源框的转录抑制因子，具有抑癌基因活性。过表达ZHX2的肝癌细胞基因芯片和ChIP-on-chip结果提示：ZHX2能够调控表观修饰基因DNMT3B的转录表达。DNMT3B在多种恶性肿瘤，包括肝细胞肝癌（HCC）中异常高表达。目前已开发出针对DNA甲基转移酶（DNMT）的化疗药物用于血液肿瘤疾病的临床治疗，但这些化学药物对于包括HCC在内的实体瘤的治疗效果有限。本课题在前期结果的基础上，首先通过瞬时转染技术在肝癌细胞模型中进一步明确ZHX2对DNMT3B的表达调控作用。进而研究ZHX2抑制DNMT3B表达后是否影响肿瘤抑制基因启动子区域的甲基化水平。最后从寻找顺式作用元件和探讨ZHX2的反式作用功能域两个角度深入探讨肝癌细胞中ZHX2调控DNMT3B表达的分子机制，为开发针对DNMT的生物制剂用于HCC的临床治疗提供理论依据。

ZHX2是一个具有锌指结构的同源框的转录抑制因子，具有抑癌基因活性。细胞表观遗传调控机制的紊乱在肿瘤的发生和发展中起到关键作用，包括DNA异常甲基化。目前已开发出针对DNA甲基转移酶（DNMTs）的化疗药物用于血液肿瘤疾病的临床治疗，但这些化学药物对保护HCC在内的实体瘤的治疗效果有限。本研究利用肝癌细胞系遗传操作ZHX2，证实过表达或干扰ZHX2能够下调或上调DNMT3B蛋白和mRNA表达水平，并且在临床肝癌组织中免疫组化检测DNMT3B和ZHX2的表达状况，结果显示DNMT3B在肝癌组织中的表达强度显著高于癌旁组织中，跟肿瘤组织大小和肿瘤TNM分期没有明显相关性，但与肿瘤组织中ZHX2的表达负相关。为了探讨ZHX2调控DNMT3B表达的分子机制，我们克隆得到DNMT3B启动子片段（-1028～+198）和短片段（-400～+50），利用双荧光素酶基因报告系统证实ZHX2过表达均能抑制其活性。ChIP-PCR也证实ZHX2与DNMT3B启动子区域结合。对免疫沉淀下来的蛋白进行质谱分析，初步确定蛋白ASAP2和POTEE可能参与ZHX2转录抑制复合物组成。从而明确ZHX2蛋白结合到DNMT3B启动子区抑制其转录表达，暗示ZHX2可以用于靶向DNMT3B的基因治疗。然而ZHX2编码区全长为2314bp，直接操作ZHX2基因全长实现基因的高效、靶向性表达是非常困难的。因此本课题通过构建ZHX2蛋白基序片段，结合双荧光素酶启动子活性检测系统，确定ZHX2(242～338aa-NLS)和ZHX2(339～446aa)片段能够分别高效抑制DNMT3B表达，更具有用于靶向DNMTs的基因治疗的开发潜能。对肝癌细胞基因组上5-mC的检测结果显示，过表达ZHX2并不能影响总体5-mC水平。RRBS对肝癌细胞基因组内启动子及CpG岛区域的甲基化状况进行分析，结果显示与5-mC检测结果一致，ZHX2过表达组与对照组中C位点的甲基化水平相近；mCG、mCHG和mCHH三种碱基类型是mC的主要组成部分，两组中mCG均是主要的甲基化胞嘧啶类型；共发现130个差异性甲基化区域（DMR），这130个DMR共指向75个基因。综上，课题实施明确了ZHX2对DNMT3B基因表达的负调控作用，并初步揭示了ZHX2转录抑制作用机制，为开发针对DNA甲基转移酶的生物制剂用于HCC的个体化临床治疗提供新思路。